Практикум по микробиологической безопасности сырья и продуктов животного и растительного происхождения

КВАДРО
Санкт-Петербург 

2022

ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ 
БЕЗОПАСНОСТИ СЫРЬЯ И ПРОДУКТОВ  
ЖИВОТНОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

УчебниКи и Учебные ПОСОбия

Для ВыСших Учебных зАВеДений

иванова О. е., Смирнова и. Р., 
Павлова е. В., Авылов Ч. К.

Рекомендовано ученым Советом института ветеринарно-санитарной экспертизы, 
биологической и пищевой безопасности федерального государственного бюджетного 
образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный 
университет пищевых производств» для магистрантов высших учебных заведений,  
обучающихся по специальности 36.04.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза»  
и  для ветеринарных специалистов государственной ветеринарной службы  
Российской Федерации

УДК 579:664 (075.8)

ISBN 978–5-906371–28–7 

© Коллектив авторов, 2022 
© ООО «Квадро», 2022

Практикум по микробиологической безопасности сырья и 
продуктов животного и растительного происхождения: учебное 
пособие / Иванова О. Е., Смирнова И. Р., Павлова Е. В., Авылов 
Ч. К. — СПб.:   ООО «Квадро», 2022. — 164 с. (Учебники и учебные 
пособия для высших учебных заведений
ISBN 978–5-906371–28–7

Цель данного пособия  –  ознакомить магистрантов с основными навыками 
санитарно-микробиологических исследований, что будет способствовать 
усвоению программного курса. Материал по каждой теме изложен в 
последовательности: цель занятия, оборудование и материалы, задания для 
самостоятельной работы студентов, контрольные вопросы, пояснения для 
выполнения студентами самостоятельной работы. Книга иллюстрирована 
фотоматериалами и таблицами.
Учебное пособие предназначено для магистрантов высших учебных заведений 
по специальности: 36.04.01– «Ветеринарно-санитарная экспертиза» 
и для ветеринарных специалистов государственной ветеринарной службы 
Российской Федерации.

Рецензенты 
Друковский Станислав Геннадьевич, к.б.н., доцент ФГАОУ ВО «Российский 
университет дружбы народов» 
Скляров Олег Дмитриевич, д.в.н., заведующий лабораторией качества и 
стандартизации бактерийных лекарственных средств ФГБУ «ВГНКИ»

Авторы 
Иванова Ольга Евгеньевна, к.в.н., заместитель заведующего отделе- 
нием  биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ»
Смирнова Ирина Робертовна, д.в.н., профессор кафедры «Ветеринарно-
санитарная экспертиза и биологическая безопасность» 
ФГБОУ ВО МГУПП
Павлова Елена Васильевна, к.б.н., доцент, профессор кафедры «Ветеринарно-
санитарная экспертиза и биологическая безопасность» 
ФГБОУ ВО МГУПП
Авылов Чолпонкул Кыдырмышевич,  д.в.н., профессор, заведующий 
кафедры «Ветеринарно-санитарная экспертиза и биологическая 
безопасность» ФГБОУ ВО МГУПП, Заслуженный ветеринарный 
врач РФ

ВВЕДЕНИЕ

Учебное пособие написано на кафедре «Ветеринарно-санитарная 
экспертиза и биологическая безопасность» Московского 
государственного университета пищевых производств. Материал 
представлен в соответствии с типовой программой по дисциплине 
«Микробиологическая безопасность сырья и продуктов животного 
происхождения», утвержденной Министерством образования Российской 
Федерации. 
Целью учебного пособия является ознакомление магистрантов 
с классическими и экспресс-методами санитарно-микробиологического 
контроля сырья и продуктов животного происхождения.
Учебное пособие состоит из четырёх разделов: «Классические 
методы исследований», «Экспресс-методы исследований», «Схемы 
исследований микроорганизмов классическими и экспресс-методами» 
и «Лабораторные работы»: «Микробиологический контроль 
мяса, мясных продуктов», «Микробиологический контроль яиц и 
яйцепродуктов», «Микробиологический контроль молока, заквасок 
и молочных продуктов», «Микробиологический контроль рыбы и 
рыбных продуктов».  
В каждую тему включены: цель занятия, оборудование и материалы, 
задания для самостоятельной работы студентов, контрольные 
вопросы, пояснения к выполнению студентами самостоятельной 
работы. Материал иллюстрирован фотоматериалами и 
таблицами и изложен в каждой теме в последовательности: цель занятия, 
оборудование и материалы, задания для самостоятельной работы 
студентов, контрольные вопросы, пояснения для выполнения 
студентами самостоятельной работы.

1. КЛАССИЧЕСКИЕ  
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1 МиКРОСКОПичеСКий МетОД

Микроскопические методы исследований включают в себя 
приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. 
В большинстве случаев результаты микроскопических исследований 
носят ориентировочный характер (например, определяют 
отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы 
лишены явных морфологических (т. е. структурных) 
внешних и внутренних особенностей. Тем не менее микроскопией 
материала можно определить некоторые морфологические 
признаки возбудителей (например, наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных 
включений и т. д.), а также установить сам факт 
наличия или отсутствия микроорганизмов в исследуемых образцах.
Существуют световая, фазово-контрастная, темнопольная 
(ультрамикроскопия), люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая 
и электронная микроскопия.

1.2 МиКРОбиОлОгичеСКий МетОД

Микробиологические методы исследований — «золотой стандарт» 
микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических 
исследований позволяют точно установить факт 
наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию 
чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, 
культуральных, биохимических, антигенных свойств 
микроорганизма. Исследование многих возбудителей включает 
также определение чувствительности к антимикробным препаратам 
(например, к антибиотикам) у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической 
оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую 
идентификацию определением фаговаров, биоваров и т. д.

1.3 биОлОгичеСКий МетОД

Биологические методы исследований направлены на определение 
наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение 
самого возбудителя (особенно при его незначительном исходном 
содержании в исследуемом образце). Методы включают в 
себя заражение лабораторных животных исследуемым материалом 
с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением 
факта присутствия микробного токсина и его природы.
Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных 
животных — важный инструмент изучения патогенеза 
заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм – 
макроорганизм. Для проведения биологических проб 
используют только здоровых животных определённой массы тела и 
возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные 
пути, внутривенно, внутримышечно, подкожно, в переднюю камеру 
глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в 
большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают 
кровь, экссудат (скопившуюся жидкость) из брюшной полости, 
после гибели — кровь, кусочки различных органов, экссудаты 
из различных полостей.

1.4 СеРОлОгичеСКий МетОД

Серологические методы исследований для выявления специфических 
антител и антигенов возбудителя — важный инструмент в 
диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они 
имеют в тех случаях, когда выделить возбудителя не представляется 
возможным. При этом необходимо выявить повышение титров 
антител (т. е. их концентрации), в связи с чем исследуют парные 
образцы сыворотки, взятые в интервале 10–20 суток (иногда этот 
интервал может быть более длительным). Aнтитела обычно появляются 
в крови на 1–2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме 
относительно долго, что позволяет использовать их выявление 
для эпидемиологических исследований.
Особое значение имеют методы выявления микробных антигенов, 
порождающих антитела. В значимых количествах они появляются 
уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию 
важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных забо-

леваний, а количественное их определение в динамике инфекционного 
процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной 
терапии.

1.5 АллеРгОлОгичеСКий МетОД

Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим 
действием, т. е. способны вызывать аллергические реакции. Это 
используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также 
при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее 
распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие 
внутрикожное введение Аг (аллергена). Кожные пробы нашли применение 
в диагностике таких заболеваний, как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. 
Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики 
туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма 
к возбудителю.

2. ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ  
ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспресс-методики исследований в современной лабораторной 
практике имеют огромное значение, так как позволяют проводить 
анализ сырья и продуктов животного происхождения гораздо быстрее, 
чем это возможно при использовании только классических 
методов исследования. Так, например, при использовании экспресс-
анализатора TEMPO® подготовку 24 образцов, исследуемых по трем 
показателям (КМАФАнМ, БГКП, S. aureus), при задействовании 
одного специалиста, возможно провести за 130 минут. Три специалиста, 
проводя те же исследования, по тем же показателям, тратят на 
ту же задачу до 830 минут (с учетом подготовки питательных сред), 
используя классические методы исследований. Особенно много 
времени тратится на процесс последовательных разведений. Также, 
много времени тратится на приготовления перед считыванием результатов 
и на выделение единичных колоний.

2.1 ФлУОРеСценция

Метод флуоресценции основан на физическом явлении, суть которого 
состоит в кратковременном поглощении кванта света флю-
орофором (веществом, способным флуоресцировать), с последующей 
быстрой эмиссией другого кванта, который имеет свойства, 
отличные от исходного. Этот метод широко используется в пищевом 
производстве и ветеринарной лабораторной практике для быстрого 
проведения микробиологических исследований с целью количественного 
учета наличия в сырье и продуктах животного происхождения, 
различных групп микроорганизмов, таких как: БГКП, 
КМАФАнМ, S. aureus, которые могут приводить не только к порче 
продуктов, но и к пищевым инфекциям и токсикозам человека и 
животных, а также влиять на количество и качество выпускаемой 
продукции.

2.1.1. Принцип работы автоматического анализатора TEMPO  
для количественного определения микроорганизмов

Количественный учет микроорганизмов по технологии TEMPO 
производится по принципу наиболее вероятного числа (НВЧ), путем 
высева разведений продукта в жидкую питательную среду, автоматически 
распределяемую по лункам контейнера (карты) ТЕМПО с 
различной емкостью, инкубирования посевов, регистрации положительных 
лунок по признакам роста в них микроорганизмов, утилизирующих 
специфические для каждой исследуемой группы или вида 
микроорганизмов субстраты с появлением флуоресцентного сигнала.
Подсчет НВЧ искомых микроорганизмов в образце продукта 
производится системой в автоматическом режиме с учетом комбинации 
количества и типа (размера) лунок в карте ТЕМПО, показавших 
положительный результат, а также степени исходного 
разведения образца с помощью таблицы НВЧ, заложенной в программное 
обеспечение прибора.
Определение КМАФАнМ (тест ТЕМПО TVC на общее число 
микробов) основано на измерении способности микроорганизмов 
продуцировать внеклеточные ферменты. В состав питательной 
среды входит специфический субстрат, меченый 4-метилумбел-
лифероном. Во время роста микроорганизмы выделяют в куль-
туральную жидкость ферменты, которые расщепляют субстрат, в 
результате чего освобождается свободный 4-метилумбеллиферон, 
обладающий флуоресценцией, при этом количество продуктов реакции 
прямо пропорционально численности популяции микроорганизмов. 
Наличие флуоресцентного сигнала считывается и фиксируется 
в автоматическом режиме ридером.

Рис. 1 – Сухие питательные среды для разведений

Определение 
количества 
бета-глюкуронидаза-позитивных 
Escherichia coli (тест ТЕМПО ЕС) основано на способности 94% 
штаммов вида Е. coli продуцировать фермент бета-глюкурони-
дазу. В состав питательной среды ТЕМПО ЕС входит специфический 
субстрат 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкуронид. Во 
время роста микроорганизмы выделяют в культуральную жидкость 
бета-глюкуронидазу, которая расщепляет субстрат. При 
этом в питательную среду выделяется свободный 4-метилумбел-
лиферон, обладающий флуоресцентной способностью. Количество 
продуктов реакции прямо пропорционально численности 
популяции исследуемых микроорганизмов. Наличие флуоресцентного 
сигнала считывается и фиксируется в автоматическом 
режиме ридером.
Определение количества бактерий семейства Enterobacteriacea 
(тест TEMPO EB) или колиформ (тест ТЕМПО ТС) основано на способности 
микроорганизмов изменять pH питательной среды за счет 
ферментации добавленных углеводов (для определения бактерий 
семейства Enterobacteriaceae – глюкозы, для колиформ – лактозы). В 
питательную среду внесен индикатор 4-метилумбеллиферон, флуоресцирующий 
только при нейтральных значениях pH (>= 6). В процессе 
роста и утилизации углеводов уровень pH снижается прямо 
пропорционально численности популяции исследуемых микроорганизмов. 
При достижении средой значений pH<= 6 флуоресценция 
4-метилумбеллиферона угасает, снижение или отсутствие флуоресцентного 
сигнала фиксируется ридером как положительный результат.

Определение количества коагулазоположительных стафилококков (
тест ТЕМПО STA) основано на способности микроорганизмов 
изменять pH питательной среды за счет ферментации 
добавленных специфических субстратов. В питательную среду 
внесен индикатор 4-метилумбеллиферон, флуоресцирующий 
только при нейтральных значениях pH (>= 6). В процессе роста 
и утилизации субстратов уровень pH снижается прямо пропорционально 
численности популяции коагулазоположительных 
стафилококков. При достижении средой значений pH<= 6 флуоресценция 
4-метилумбеллиферона угасает, снижение или отсутствие 
флуоресцентного сигнала фиксируется ридером как положительный 
результат.
Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды. Комплект 
оборудования (станция) для пробоподготовки посредством 

разведения образцов пищевых продуктов, инокулирования питательных 
сред, заполнения и запаивания карт, в который входят: дис-
пенсеры для разведения питательных сред, штативы для заполнения 
карт ТЕМПО (вместимостью 6 карт).

Рис. 2 – Штативы для инкубации и считывания карт ТЕМПО  
(вместимостью 20 карт)

Рис. 3 – Вакуумная станция для заполнения и запаивания карт  
(TEMPO Filler)