Биотехнология : практикум по культивированию клеточных культур

БИОТЕХНОЛОГИЯ

ПРАКТИКУМ ПО КУЛЬТИВИРОВАНИЮ 

КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Москва

ИНФРА-М

202УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Рекомендовано Межрегиональным учебно-методическим советом профессионального 
образования в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, 

обучающихся по направлениям подготовки 06.03.01 «Биология», 

19.03.01 «Биотехнология» (квалификация (степень) «бакалавр») 

(протокол № 12 от 24.06.2019)

УДК 576.5(075.8)
ББК 28.05я73
 
Б63

Б63  
Биотехнология. Практикум по культивированию клеточных 
культур : учебное пособие / М.Ш. Азаев, Т.Н. Ильиче-
ва, Л.Ф. Бакулина [и др.]. — Москва : ИНФРА-М, 2023. — 
142 с. + Доп. материалы [Электронный ресурс]. — (Высшее 
образование: Бакалавриат). — DOI 10.12737/993530.

ISBN 978-5-16-014611-9 (print)
ISBN 978-5-16-107108-3 (online)
В учебном пособии представлены основные методические 

подходы к работе с культурами клеток: ведение клеточных 
культур, их пассирование, подсчет клеток в единице объема, 
приготовление 
раство ров 
антибиотиков, 
диспергирующих 

раство ров и питательных сред для работы с клеточными культурами, 
контаминация клеточных культур и методы ее обнаружения, 
крио консервация клеток, техника безопасности при работе 
в боксовом помещении с клеточными культурами, биобезопа-
сность при работе с клеточными культурами.

Соответствует требованиям федеральных государственных 

образовательных стандартов высшего образования последнего 
поколения.

Предназначено для специалистов и студентов бакалавриата, 

квалифицирующихся в области биотехнологии и вирусологии 
для решения задач широкого диапазона.

УДК 576.5(075.8)

ББК 28.05я73

Р е ц е н з е н т ы:

Беклемишев А.Б., доктор биологических наук, профессор, 
заведующий лабораторией Научно-исследовательского 
института биохимии Сибирского отделения Российской 
академии наук;

Полтавченко А.Г., доктор биологических наук, заведующий 
лабораторией Государственного научного центра вирусологии 
и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

ISBN 978-5-16-014611-9 (print)
ISBN 978-5-16-107108-3 (online)
 © Коллектив авторов, 2019

Материалы, отмеченные знаком 
, 

доступны в электронно-библиотечной системе Znanium

Авторский коллектив

Мамедьяр Шакирович Азаев, доктор биологических 
наук, доцент, заведующий отделом научно-методической 
подготовки персонала по работе с возбудителями 
особо опасных инфекций Государственного 
научного центра вирусологии и биотехнологии 
«Вектор» Роспотребнадзора;
Татьяна Николаевна Ильичева, доктор биоло-
гических наук, доцент, заведующий лабораторией 
серодиагностики гриппа отдела зоонозных инфекций 
и гриппа Государственного научного центра вирусо-
логии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Людмила Федоровна Бакулина, научный со-
трудник отдела научно-методической подготовки 
персонала по работе с возбудителями особо опасных 
инфекций Государственного научного центра вирусо-
логии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Александра Анатольевна Дадаева, кандидат био-
логических наук, старший научный сотрудник отдела 
научно-методической подготовки персонала по работе 
с возбудителями особо опасных инфекций Государ-
ственного научного центра вирусологии и биотехно-
логии «Вектор» Роспотребнадзора;
Екатерина Сергеевна Олейникова, младший на-
учный сотрудник отдела научно-методической под-
готовки персонала по работе с возбудителями особо 
опасных инфекций Государственного научного центра 
вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотреб-
надзора;
Леонид Рудольфович Лебедев, доктор меди-
цинских наук, заведующий лабораторией Государ-

Авторский коллектив

ственного научного центра вирусологии и биотехно-
логии «Вектор» Роспотребнадзора;
Вадим Николаевич Гуреев, кандидат педагоги-
ческих наук, старший научный сотрудник Государ-
ственного научного центра вирусологии и биотехно-
логии «Вектор» Роспотребнадзора;
Сергей Викторович Нетёсов, доктор биологи-
ческих наук, профессор, член-корреспондент Рос-
сийской академии наук, заведующий лабораторией 
биотехнологии и вирусологии Новосибирского нацио-
нального исследовательского государственного уни-
верситета;
Александр Петрович Агафонов, доктор биологи-
ческих наук, заместитель генерального директора по 
научной работе Государственного научного центра ви-
русологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнад-
зора.

Список условных сокращений

БМБ — бокс микробиологической безопасности;
ДЖ, % — доля живых клеток, %;
ДМЕМ (DMEM, Dulbecco modified Eagle’s 
medium) — минимальная эссенциальная среда Игла, 
модифицированная по способу Дульбекко;
ДМСО — диметилсульфоксид;
ИП — индекс пролиферации;
КРС — крупный рогатый скот;
ЛВЖ — легковоспламеняющаяся жидкость;
МТТ — 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-ди-
фенил-2Н-тетразолий бромид;
ОП — оптическая плотность;
ПБА — патогенный биологический агент;
ПЦР — полимеразная цепная реакция;
РКЭ — развивающийся куриный эмбрион;
СОП — стандартная операционная процедура;
ТЦИД — тканевая цитопатическая инфекци-
онная доза;
УФО — ультрафиолетовое облучение;
ФЭК — фибробласты эмбрионов кур;
ФИО — фамилия, имя, отчество;
хч — химически чистый;
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота;
MDCK (Madin — Darby canine kidney) — клетки 
Мадин — Дарби почек собак.

Введение

С середины 50-х гг. XX столетия культуры клеток 
широко используются в различных областях био-
логии, медицины и ветеринарии. За прошедшее время 
культуры клеток, которые служили вначале объектом 
и инструментом исследований, в ходе интенсивного 
развития технологий стали основой для значительной 
части биотехнологических и биофармацевтических 
производств. Во многих исследованиях культуры 
клеток являются адекватной заменой использованию 
лабораторных животных. В настоящее время можно 
получать и культивировать клетки практически 
из любых органов и тканей млекопитающих, рыб, на-
секомых, растений и других организмов. В результате 
культивируемые клетки применяются во многих на-
укоемких технологиях, в том числе непосредственно 
в медицине. С применением клеток человека и жи-
вотных в промышленных масштабах налажено произ-
водство вакцин, диагностикумов, гормонов, терапев-
тических рекомбинантных белков и других биологи-
чески активных веществ.
Вместе с тем работа с культурами клеток требует 
высокой квалификации специалистов, специальных 
условий и оборудования для проведения работ, на-
личия качественных реактивов и посуды. При этом 
квалификация и методические навыки специалистов 
являются крайне важными факторами. По этой при-
чине, а также из-за растущей востребованности работ 
с культурами клеток предлагаемый практикум явля-
ется актуальным учебно-методическим пособием, со-
держащим детальное описание методов и приемов работ 

Введение

с клеточными культурами. В практикуме представлен 
широкий ассортимент методик по работе с культу-
рами клеток: ведение клеточных культур, включая 
их пассирование и подсчет клеток в единице объема; 
приготовление различных вспомогательных раство ров 
для поддержания жизнедеятельности клеток, методы 
выявления контаминации клеточных культур и спо-
собы борьбы с ней, криоконсервация клеток, техника 
безопасности при работе в боксовом помещении с кле-
точными культурами, биобезопасность при работе 
с клеточными культурами в целом. Этот практикум 
будет полезен для получения надежных навыков ра-
боты с культурами клеток и в качестве методического 
пособия для решения тех или иных проблем, возника-
ющих в рабочих ситуациях.
Практикум предназначен для специалистов и сту-
дентов бакалавриата, квалифицирующихся в области 
биотехнологии для решения задач широкого диа-
пазона.
В результате изучения практикума студенты 
будут:
 
• знать основные требования, предъявляемые к ор-
ганизации вирусологической (микробиологической) 
лаборатории и работе персо нала в ней, к правилам 
оформления лабораторных журналов и прочей от-
четной документации;
 
• уметь ориентироваться в реестре санитарно-эпи-
демиологических докумен тов и инструкций, поль-
зоваться средствами индивидуальной защиты, экс-
плуатировать лабораторное оборудование (в частности, 
боксы микробиологической безопасности, 
дозаторы, микроскопы), разводить и тестировать 
раство ры;

Введение

 
• владеть основами работы с культурами клеток 
и лабораторными методиками; правилами обращения 
с лабораторной посудой, реактивами, соблюдения 
стерильности процедур на всех этапах исследования.

1. Понятие культуры клеток

Первые опыты по выращиванию клеток в искусственных 
условиях, т.е. вне организма (in vitro), 
были предприняты в XIX в. Английский физиолог 
С. Рингер (S. Ringer) разработал несколько типов 
солевых раство ров, содержащих хлориды натрия, 
калия, кальция, магния и бикарбонат натрия, 
для поддержания биения сердца животных вне организма. 
В 1885 г. немецкий ученый В. Ру (Wilhelm 
Roux) сформировал основы культивирования тканей. 
В частности, он извлекал часть костного мозга из куриного 
эмбриона и держал его в теплом физиологическом 
растворе в течение нескольких дней без потери 
жизнеспособности и гистологических особенностей. 
Р.Г. Харрисон (Ross Granville Harrison), работавший 
в Медицинской школе Университета Джонса Хоп-
кинса, а затем в Йельском университете, создал мето-
дологию культивирования тканей животных и чело-
века и опубликовал в 1907–1910 гг. результаты своих 
эксперимен тов. Данная техника выращивания тканей 
была названа культивированием клеток.
Большой вклад в развитие и совершенствование 
методологии внесли:
 
• французский хирург и биолог А. Каррель (A. Car -
rel) — в 1912 г. он создал и использовал систему 
строгих правил асептики, которая позволила 
в течение нескольких месяцев культивировать 
фрагмен ты тканей цыпленка;
 
• П. Раус и Ф.С. Джонс (P. Raus, F.S. Jons), которые 
в 1916 г. разработали методику трипсинизации 
и субкультивирования;

1. Понятие культуры клеток

 
• У. Эрл с группой ученых (W.R. Earle, E.L. Schilling, 
T.H. Stark et al.), которые в 1943 г. получили 
первую перевиваемую линию клеток L.

Рис. 1.1. В лаборатории А. Карреля

Организация и технические условия проведения 
эксперимен тов были в то время очень неудобными 
и громоздкими. Ассистенты Карреля были одеты 
в длиннополые резиновые халаты темного цвета 
с капюшонами, полностью закрывавшими голову 
(рис. 1.1).
В 1910 г. американский исследователь П. Раус 
обнаружил, что культура клеток саркомы цыпленка 
способна вызывать образование опухолей у здоровых 
животных. Позже это привело к открытию им и его 
коллегами онкогенных вирусов. За эти открытия 
в 1966 г. доктор П. Раус получил Нобелевскую 
премию.
Клетки, выделенные из раковых опухолей 
или трансформированные в ходе культивирования 
диплоидных клеток, характеризовались как бес-
смертные. Первые суспензионные культуры клеток 
животных и человека, как правило, формировались 
из клеток злокачественных тканей. Так, первая пере-