Взаимодействие антигенов с антителами и с иммунокомпетентными клетками (количественные аспекты)

Взаимодействие антигенов 

с антителами 

и с иммунокомпетентными 

клетками

(количественные аспекты)

МОНОГРАФИЯ

Москва 

ИНФРА-М 

202Н.Г. ТИТОВА

ISBN 978-5-16-015943-0 (print)
ISBN 978-5-16-108335-2 (online)
© Титова Н.Г., 2019

УДК 578(075.4)
ББК 28.074
 
Т45

Титова Н.Г.

Т45 
 
Взаимодействие антигенов с антителами и с иммунокомпетентными 

клетками (количественные аспекты) : монография / Н.Г. Титова. — 
Москва : ИНФРА-М, 2023. — 186 с. — (Научная мысль).

ISBN 978-5-16-015943-0 (print)
ISBN 978-5-16-108335-2 (online)

В монографии представлен новый взгляд на оценку наблюдаемых в экспериментах 
явлений в вирусологической и иммунологической практике с учетом 
дозовой неоднородности взаимодействующих компонентов.

В первой главе рассматривается процесс нейтрализации дискретных частиц (
одиночных вирионов и их конгломератов). Данный процесс изучен в соответствии 
с теорией Клотца, учитывающей неоднородность частиц по размеру  
в белковых системах. Определена фактическая сущность ряда явлений, обычно 
расцениваемых как взаимодействие вируса с антителами большей или 
меньшей авидности. Во второй главе впервые представлены экспериментальные 
доказательства того, что в иммуноферментном анализе взаимодействие 
антигена со специфическими антителами соответствует известным законо-
мерностям физико-химической адсорбции. На основе этого создана модель 
взаимодействия компонентов при разных количественных соотношениях.  
В третьей главе описана новая концептуальная модель иммунного ответа 
лимфоцитов, учитывающая дозовую неоднородность воздействия и свойства 
антигена. По-новому трактуются процессы, происходящие в герминальных 
центрах.

Предназначена для специалистов в области вирусологии и иммунологии, 

аспирантов и студентов высших учебных заведений биологического и меди-
цинского профилей.

УДК 578(075.4) 

ББК  28.074

Список сокращений

CHO – клетки яичников сирийского хомяка
CMV – цитомегаловирус
ConA – конканавалин А
DLM – минимальная летальная доза
Lf – флокулирующая единица
MHC — главный комплекс гистосовместимости
MTOC – микротубулярный центр Т-клеток
OD – оптическая плотность
PFC – пятнообразующие клетки
PPD – очищенные дериваты туберкулина
Th – Т-хелперы
UA – универсальные рабочие единицы
VSV – вирус везикулярного стоматита
Аг – антиген
АОК – антителообразующая клетка
Ат – антитело
БОЕ – бляшкообразующие единицы
ВИЧ — вирус иммунодефицита человека
ДАТ – дифтерийный анатоксин
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТ – дифтерийный токсин
ИК — иммунные комплексы
ИФА – иммуноферментный анализ
КББ – карбонат-бикарбонатный буферный раствор
ЛПС – липополисахарид
МЕ – международные единицы
МкАт — моноклональные антитела
МЦТД – минимальная цитотоксическая доза
ПДС – противодифтерийная сыворотка лошади
ПкАт — поликлональные антитела
ПХ — пероксидаза хрена
РНК — рибонуклеиновая кислота
СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита
Т-10 – антиген Т-клеток

ВВЕДЕНИЕ

Взаимодействию антигенов и антител посвящено много работ  

в различных областях иммунологии. Антитела (в том числе и моно-
клональные) все чаще становятся инструментом исследования при 
определении структуры антигенов, их эпитопной специфичности. 
При этом наряду с качественными методами часто применяют ко-
личественные, например, метод оценки взаимодействия антигенов 
и антител в иммуноферментном анализе (ИФА), а также в реакциях 
конкурентного связывания антител. Кинетику взаимодействия ан-
тигенов и антител наблюдать трудно из-за быстроты протекания 
этого процесса. Однако есть область иммунологии, в которой этот 
процесс рассмотрен в динамике и в различных аспектах. Это взаимодействие 
вирусов с антителами (глава 1 монографии).

Анализ экспериментальных данных, посвященных указанному 

вопросу, проведен с позиций признания объективно существующей 
(но, как правило, не учитываемой при оценке взаимодействия) неоднородности 
исследуемых вирусных взвесей (дискретные частицы: 
одиночные вирионы и конгломераты из разного их числа), и, следовательно, 
неоднородности выявляемых при титровании в культуре 
клеток дискретных очагов поражения (инфекционных единиц).  
С этих позиций рассмотрен процесс нейтрализации вирусов специфическими 
антителами. Такой подход позволил дать новую оценку 
ряду известных понятий, в частности, авидности вирусов и авид-
ности антител. Представлено новое понимание процессов, которые 
принято считать «созреванием» авидности антител.

Количественные аспекты взаимодействия антигенов и антител 

на молекулярном уровне рассмотрены на примере взаимодействия 
специфических антител с токсином (глава 2 монографии).

Вирус и токсин отличаются по своим размерам и свойствам, 

представляя макромолекулярный и молекулярный уровень. И по-
тому их сравнение представляет особый интерес. Поскольку речь 
идет о количественной оценке взаимодействия, в обоих случаях 
исследованы факторы, влияющие на этот процесс. В данном раз-
деле монографии впервые представлены экспериментальные дока-
зательства того, что в иммуноферментном анализе специфические 
антитела взаимодействуют с антигеном на поверхности планшета  
в соответствии с закономерностями физико-химической ад-
сорбции. На основе выявленных закономерностей создана модель 
взаимодействия при разных количественных соотношениях сме-
шиваемых компонентов. Модель нашла подтверждение в опытах. 

Дана новая интерпретация явлений в экспериментах, обычно рас-
цениваемых как свидетельство «созревания авидности антител»  
в процессе иммунного ответа.

Глава 3 монографии посвящена количественным аспектам взаи-

модействия антигенов с иммунокомпетентными клетками.

Впервые анализ работ по изучению взаимодействия иммуноком-

петентных клеток и антигена с позиций признания его неоднород-
ного воздействия на клеточном уровне проделан автором в 1982 г. 
В последующем (1996) предложена новая концептуальная модель 
иммунного ответа лимфоцитов, учитывающая дозовую неоднород-
ность антигена и его свойства (тимусзависимый или тимуснеза-
висимый антиген). За истекший с того времени период разными 
исследователями были получены экспериментальные данные, ко-
торые свидетельствуют в пользу предложенной новой концепции.  
В монографии предложенная модель нашла дальнейшее обо-
снование и развитие с учетом новых данных. Представлены соб-
ственные экспериментальные данные об индукции первичного 
иммунного ответа в системе in vitro к антигенам возбудителя ме-
лиоидоза.

Глава 1

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ  
С АНТИТЕЛАМИ И КЛЕТКАМИ

Титова Н.Г.

1.1. АДСОРБЦИЯ ВИРУСА КЛЕТКОЙ,  

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ

Адсорбция вируса клетками — первый этап, от которого зависит 

точность количественной оценки числа дискретных инфекционных 
частиц в суспензии вируса. Установлено, что процесс адсорбции 
определяется наличием у клеток специфических рецепторов  
и имеет физико-химическую природу. Роль клеточных рецепторов 
в специфической адсорбции исследована на модели полиовирусов 
[1–3], вируса вакцины [4–6], энтеровирусов [7], миксовирусов  
[8–11] и других [12].

Адсорбция вируса протекает более эффективно в гомологичной 

системе, т.е. в той, в которой вирус был выращен. Инактивиро-
ванный вирус адсорбируется так же, как активный. Это очень 
важное наблюдение, так как целый ряд феноменов, оцениваемых 
количественно, является отражением одновременного заражения 
клеток активными, инактивированными и дефектными вирио-
нами, играющими определенную роль в процессе инфекции.

Наиболее полные и объективные результаты количественной 

оценки процесса адсорбции были получены при одновременном 
применении метода электронной микроскопии (подсчет вирионов) 
и биологического титрования (определения числа инфекционных 
единиц БОЕ/мл) [9–14]. В большинстве случаев адсорбцию вируса 
оценивали только с помощью биологического титрования. Такого 
рода биологические характеристики имеют ограниченное при-
менение: они дают представление лишь о том, какое количество 
инфекционных единиц (от общего их числа) может быть адсорби-
ровано при данных конкретных условиях. Такие способы оценки 
не могут быть использованы для сравнительной характеристики 
свойств вирусов, так как заведомо могут содержать ошибку: они 
могут не отражать истинные концентрации (суммарное содержание 
инфекционных и неинфекционных частиц) вирионов в сравни-
ваемых образцах. Между тем известно, что скорость адсорбции 

зависит от концентрации частиц, обладающих одинаковым срод-
ством к данному адсорбенту. В том случае, когда происходит ад-
сорбция смеси компонентов, обладающих одинаковым сродством 
к адсорбенту, скорость их адсорбции определяется их суммарной 
концентрацией.

1.2. ЦИТОМОРФОЛОГИЯ КАК ПРОЯВЛЕНИЕ  

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСА

Начальные стадии взаимодействия вируса с клеткой с привле-

чением электронной микроскопии, радиобиологических и имму-
нологических методов исследования изучены на модели вируса 
вакцины [5; 6], миксовирусов [10–13]. Эти исследования показали, 
что возможно проникновение в клетку как небольшого числа вири-
онов, так и множественное заражение.

Так, например, Nielsen G., Peters D. [13] наблюдали взаимо-

действие вируса вакцины с клеткой при высоких дозах вируса  
(100 БОЕ на 1 клетку). Было установлено, что после адсорбции 
вирус погружается в пиноцитические вакуоли. В вакуолях были 
видны как одиночные вирионы, так и группы вирионов (конгло-
мераты) разной величины. Несмотря на высокую множественность 
заражения, авторы не заметили токсического эффекта.

Существует мнение, что посредством пиноцитоза в клетку про-

никают лишь достаточно крупные вирионы или их конгломераты. 
Полагают, что мелкие вирусы проникают в клетку без предвари-
тельного погружения в вакуоль путем непосредственного взаимо-
действия оболочки вириона с клеточной мембраной.

Находясь в пиноцитической вакуоли, вирус не претерпевает 

каких-либо структурных изменений: нуклеокапсид сохраняет при-
сущую ему белковую оболочку и внутреннюю структуру, разруша-
ется лишь внешняя фосфолипидная оболочка [5; 6].

Специфическое же взаимодействие находящихся в вакуоли 

вирионов с клеткой и проникновение в цитоплазму так же, как  
и у мелких вирусов, осуществляется путем ассоциации оболочки 
нуклеокапсида с клеточной мембраной. По-видимому, это общий 
способ специфического мембранного взаимодействия для всех ви-
русов животных. Об этом свидетельствуют многие факты. В част-
ности, явление слияния инфицированных клеток, образование 
симпластов и поликариоцитов, видимо, могут рассматриваться как 
явления такого же рода.

Установлено, что у вируса вакцины ответственными за процесс 

слияния мембран являются тубулы, расположенные на поверх-
ности вириона. Они же являются антигенными детерминантами, 

индуцирующими синтез нейтрализующих вирус антител. Антитела, 
прикрепляясь к тубулам, делают невозможным слияние мембран  
и, следовательно, предотвращают попадание нуклеокапсида вируса 
в цитоплазму.

Электоронно-микроскопические наблюдения [8] говорят о том, 

что нейтрализованный вирус адсорбируется клеткой и подверга-
ется пиноцитозу так же, как не нейтрализованный, но его внутри-
клеточная судьба иная. В отличие от последнего, он так и остается  
в пиноцитической вакуоли, подвергаясь в дальнейшем деградации. 
Равным образом, вирус вакцины, инактивированный нагреванием, 
хорошо адсорбируется клеткой, подвергается пиноцитозу, но в ци-
топлазму клетки не проникает. Видимо, изменившиеся при нагре-
вании тубулярные структуры утрачивают способность взаимодей-
ствовать с клеточной мембраной. Аналогичные данные получены  
и для других вирусов [11].

1.3. КОМПЛЕКС «ВИРУС — АНТИТЕЛА»,  

ЕГО ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СУДЬБА

Во взвеси вируса с антителами в физиологических условиях про-

исходит взаимодействие антител с поверхностью вириона. Элек-
тронно-микроскопические исследования позволили определить, 
как осуществляется это взаимодействие. Установлено, что моле-
кулы антител могут прикрепляться к поверхности вириона либо 
одним концом, либо обоими концами (паратопами), либо обра-
зуют мостики между соседними вирусными частицами, объединяя 
их в иммуноагрегат [14; 15]. В зависимости от используемых кон-
центраций антител в реакционной смеси на поверхности вириона 
находили разное число молекул [15–17]. До сих пор остается от-
крытым вопрос о том, какое количество антител необходимо для 
того, чтобы вирус оказался нейтрализованным. По данным неко-
торых авторов на поверхности вируса гриппа может быть связано 
от 1200 до 6000 молекул антител [17]. Учитывая данные о процессе 
проникновения в клетку (слияние мембран), можно полагать, что 
для нейтрализации вирусов животных необходимо прикрепление 
такого количества антител, которое было бы надежным препят-
ствием для слияния вирусной и клеточной мембран, т.е. достаточно 
большое количество.

Комплекс «вирус — антитела» при физиологической ионной 

силе стабилен, но изменение pH среды, обработка ультразвуком 
могут привести к диссоциации комплекса [18–21]. Освободив-
шийся от антител вирус не утрачивает инфекционную активность 

и способен быть вновь нейтрализованным. Это говорит о том, что 
антитела не обладают вирулицидным действием и о том, что нейтра-
лизованный вирус какое-то время остается потенциально активным.

Довольно подробно исследован процесс адсорбции нейтра-

лизованных комплексов клетками. С помощью изотопной метки  
и биологического титрования было показано, что нейтрализо-
ванные комплексы адсорбируются клеткой почти в той же степени, 
что и не нейтрализованный вирус [22]. Более того, нейтрализо-
ванные комплексы были найдены внутри пиноцитических ваку-
олей [23; 24]. Биохимические и электронно-микроскопические ис-
следования показали, что нейтрализованный вирус кроличьей оспы 
и вакцины остается внутри пиноцитической вакуоли, не проникая 
в цитоплазму. При этом он полностью лишается фосфолипидной 
оболочки и далее подвергается деструкции.

Все эти факты говорят о том, что антитела каким-то образом 

препятствуют проникновению нуклеоида в цитоплазму клеток. 
Учитывая известные данные о механизме проникновения вируса  
в клетку, можно полагать, что антитела так модифицируют обо-
лочку вириона, что она оказывается неспособной к слиянию с кле-
точной мембраной.

Таким образом, установлено, что образующиеся в результате ре-

акции нейтрализованные комплексы адсорбируются клеткой, по-
падают в пиноцитические вакуоли, и там вирус прекращает свое 
существование. Так, электронно-микроскопические наблюдения 
ряда исследователей [8–12] говорят о том, что внутри пиноцитиче-
ских вакуолей нейтрализованные комплексы подвергаются дегра-
дации, по-видимому, за счет клеточных ферментов. Об этом сви-
детельствует обнаруживаемая расплывчатость структур вириона. 
Образно характеризуя эту ситуацию, можно сказать, что клетка вос-
принимает нейтрализованный вирус как чужеродную субстанцию  
и переваривает ее в вакуоли.

1.4. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ 

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА И АНТИТЕЛ

В сущности, реакция взаимодействия вируса и антител — это 

качественная реакция, демонстрирующая соответствие молекул ан-
тител антигенным детерминантам вириона. Может быть найдено 
наличие такого соответствия или отсутствие его. Однако возмож-
ность существования у вириона не одного, а нескольких, разных 
по специфичности антигенов, т.е. антигенной мозаики, и вместе 
с тем возможность разных количественных соотношений этих ан-
тигенов у разных штаммов вирусов позволяли надеяться выявить 

эти различия с помощью некоторых количественных методов. Та-
кими методами могут быть, с одной стороны, исследование кине-
тики нейтрализации, а с другой, — определение величины устой-
чивой не нейтрализуемой фракции вируса, образующейся в конце 
реакции. Наконец, в последние годы развиты методы определения 
антигенной мозаики на поверхности вириона с помощью монокло-
нальных антител к эпитопам поверхности.

1.5. КИНЕТИКА РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

Наиболее ранние и систематические исследования кинетики реакции 
нейтрализации вирусов произведены Andrews C.H., Elford W.J. 
[25; 26], а также Burnet F. [27] на модели фагов и вируса вакцины. Кинетика 
реакции нейтрализации была исследована у многих других 
вирусов животных и человека [19–21; 28–33]. Исследуя процесс 
нейтрализации вируса, обычно используют большие концентрации 
антител, в избытке по отношению к вирусу. Это позволяет считать 
концентрацию антител постоянной в ходе реакции и рассматривать 
процесс только по отношению к вирусу. О том, что антитела  
в смесях были в избытке, судили на основании эксперимента: добавление 
к реакционной смеси свежей порции вирионов и последующее 
определение кинетики нейтрализации добавленного вируса 
позволяло убедиться в том, что кинетика нейтрализации и уровень 
устойчивой фракции в обеих порциях вируса были одинаковыми 
[21; 28]. То есть концентрация антител в начале и конце реакции 
(независимо от использованной концентрации вируса) остается 
(в известных пределах) практически неизменной. В большинстве 
случаев реакция нейтрализации происходит быстро, без лаг-фазы  
и характеризуется экспоненциальным снижением активности ви-
руса в первые минуты взаимодействия [18; 28; 30]. Характер кривой 
нейтрализации и отсутствие лаг-фазы в начале реакции некоторыми 
исследователями расценивались как свидетельство того, что одной 
молекулы антител было достаточно для нейтрализации вируса. Од-
нако другие исследователи при изучении процесса нейтрализации 
в серии разведений антител показали, что вирусная частица может 
адсорбировать много антител и при этом остаться инфекционной. 
Лишь в немногие первые минуты реакция нейтрализации проте-
кает как реакция первого порядка. В дальнейшем наблюдаются за-
медление процесса, формирование устойчивой не нейтрализуемой 
фракции, уровень которой и время формирования зависят от кон-
центрации используемых в реакции антител [17; 18; 20; 28; 31].