Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования

«Казанский национальный исследовательский

технологический университет»

И. А. Дегтярева, А. С. Сироткин

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ 
ПОТЕНЦИАЛ ПОЧВЕННЫХ 

МИКРООРГАНИЗМОВ

Учебно-методическое пособие

Казань

Издательство КНИТУ

2019

УДК 631(075)
ББК 40.3я7

Д26

Печатается по решению редакционно-издательского совета 

Казанского национального исследовательского технологического университета

Рецензенты:

проф. О. Н. Ильинская
проф. М. Р. Шарипова

Д26

Дегтярева И. А.
Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов
: 

учебно-методическое пособие / И. А. Дегтярева, А. С. Сироткин; 
Минобрнауки России, Казан. нац. исслед. технол. ун-т. – Казань : 
Изд-во КНИТУ, 2019. – 112 с.

ISBN 978-5-7882-2647-7

Рассмотрены методы изучения перспектив и возможностей почвенного 

микронаселения для последующего создания на основе эффективных микро-
организмов биопрепаратов комплексного действия. 

Предназначено для студентов, обучающихся по образовательным про-

граммам подготовки магистров по направлению 19.04.01 «Биотехнология».

Подготовлено на кафедре промышленной биотехнологии.

ISBN 978-5-7882-2647-7
© Дегтярева И. А., Сироткин А. С., 2019
© Казанский национальный исследовательский 

технологический университет, 2019

УДК 631(075)
ББК 40.3я7

СОДЕРЖАНИЕ

Сокращения и условные обозначения ..................................................... 4
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................... 5
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ПОЧВЕННЫХ 
МИКРООРГАНИЗМОВ............................................................................ 6
Роль почвы как глобального биогеохимического реактора .................. 6
Фиксация азота микроорганизмами в ризосфере 
и ризоплане растений ................................................................................ 7 
Значимость почвенных фосфатмобилизующих 
микроорганизмов  .................................................................................... 11 
Алгоритм выделения агрономически ценных автохтонных 
микроорганизмов .................................................................................... 13
Лабораторная работа 1  ........................................................................... 16 
ПОДГОТОВКА К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ........... 29 
Отбор и подготовка проб почвы ............................................................ 29 
Питательные среды для различных физиологических групп 
микроорганизмов  .................................................................................... 31 
Лабораторная работа 2  ........................................................................... 34 
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И МЕТОДЫ УЧЕТА 
МИКРООРГАНИЗМОВ  ......................................................................... 44 
Лабораторная работа 3 ............................................................................ 52 
Лабораторная работа 4 ............................................................................ 58 
МЕТОДЫ И ТЕХНИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР 
МИКРООРГАНИЗМОВ .......................................................................... 61 
Лабораторная работа 5 ............................................................................ 63 
Лабораторная работа 6 ............................................................................ 70 
Лабораторная работа 7 ............................................................................ 73 
Лабораторная работа 8 ............................................................................ 76 
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................ 80 
Словарь терминов и понятий .................................................................. 81 
Список использованной и рекомендуемой литературы ..................... 103 

Сокращения и условные обозначения

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота 
БАВ – биологически активные вещества 
БФР – бактериальные факторы роста
ГА – глюкозо-автолизатная среда
ГМО – генетически модифицированный организм 
греч. – греческий язык
КОЕ – колониеобразующая единица
лат. – латинский язык
МБП – микробиологические препараты 
мол. м. – молекулярная масса 
МПА – мясопептонный агар 
МПБ – мясопептонный бульон
МПР – метод предельных разведений
нем. – немецкий язык
ПД – почвенное дыхание
ПДК – предельно допустимая концентрация
ППВ – полная полевая влагоемкость
ПС – питательные среды
РТ – Республика Татарстан
РФ – Российская Федерация
СМБ – суммарная микробная биомасса 
США – Соединенные Штаты Америки
УФО – ультрафиолетовое облучение
франц. – французский язык
ф. р. – физиологический раствор
CO2 – углекислый газ

ВВЕДЕНИЕ

Микроорганизмы используются в биотехнологических процес-

сах для различных промышленных и экологических потребностей. 
Почва представляет собой поверхностный слой литосферы Земли, об-
ладает плодородием и является природным банком различных микро-
организмов. 

Предлагаемое учебно-методическое пособие способствует при-

обретению знаний и навыков по освоению методов изучения перспек-
тив и возможностей почвенного микронаселения для последующего со-
здания на основе эффективных микроорганизмов биопрепаратов ком-
плексного действия. Основное внимание уделено выделению, отбору и 
изучению автохтонных азотфиксирующих и фосфатмобилизующих 
микроорганизмов. Авторами предложен алгоритм создания биопрепа-
ратов комплексного действия на основе адаптированных к местным 
условиям микроорганизмов, который позволяет сократить время для их 
выделения и изучения. Изложены общие принципы работы с агрономи-
чески ценными почвенными микроорганизмами. Приводятся классиче-
ские и современные методы их количественного учета, выделения, хра-
нения эффективных штаммов с мониторингом различных свойств.
В пособии приведены теоретический материал по каждой теме, словарь
терминов и понятий. 

Авторы надеются, что представленный материал будет понятен и 

доступен студентам, специалистам в области биотехнологии, сельско-
хозяйственной микробиологии, агроэкологии и близких к ним специаль-
ностей, которые получат реальную возможность самостоятельно ставить и 
решать многие методические и практические вопросы в сфере защиты 
окружающей среды в целом и почвенных экосистем в частности.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ 

ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Роль почвы как глобального биогеохимического реактора

Почва – это своеобразная природная мембрана, регулирующая

взаимодействие между биосферой, гидросферой и атмосферой нашей 
планеты. Важная роль принадлежит микробным сообществам, которые
позволяют оценить состояние почвы, определяют функционирование 
экосистемы в соответствии с биогеохимическими процессами [1, 2].

Биотехнология рассматривает почву в качестве главного природ-

ного банка при поиске культур микроорганизмов с любыми необходи-
мыми свойствами [3–6]. Для этого имеется много оснований. Современ-
ное общество заинтересовано в производстве экологически чистой про-
дукции с наименьшими затратами и минимальным риском для окружа-
ющей среды. 

Анализ основных тенденций развития сельскохозяйственной 

сферы в наиболее развитых и технически оснащенных странах мира по-
казывает все возрастающий интерес к идее биологизации, экологизации 
и устойчивости земледелия. Ведущее место при этом принадлежит поч-
венной микробиологии, поскольку микроорганизмы являются одним из 
ключевых факторов почвообразовательного процесса, питания расте-
ний и фитосанитарного состояния почвы. Исследования последних лет 
существенно расширили и углубили сведения в этой области, вывели 
их на молекулярный уровень. Однако представления о роли микроорга-
низмов ризосферы в жизни растений основаны главным образом на зна-
нии потенциальных функциональных возможностей отдельных видов и 
штаммов микроорганизмов, выделенных и изученных в чистых культу-
рах на искусственных питательных средах. Поэтому необходима разра-
ботка подходов и создание рекомендаций, позволяющих выявить био-
технологический потенциал автохтонной почвенной микрофлоры.

Известно, что коэффициенты использования растениями действу-

ющего вещества из минеральных удобрений чрезвычайно низки. Так, 
усвоение минерального азота не превышает 35–50 %, фосфора – 15–
20 %, калия – 25–60 % в зависимости от почвенно-климатических усло-
вий выращивания растений [7]. Кроме того, избыточное применение 
минеральных удобрений снижает разнообразие бактериальных сооб-
ществ [8] и активность почвенных бактерий, способствующих росту 
растений [9, 10].

Одним из решений проблемы оптимизации почвенно-микробио-

логических процессов в агроценозах является применение микробных
препаратов различной функциональной направленности, которые поз-
воляют создать высокую концентрацию полезных микроорганизмов в 
нужном месте и в нужное время [11–19]. Применение биопрепаратов и 
биоудобрений, обладающих широким спектром действия и полифунк-
циональными свойствами, является необходимым элементом альтерна-
тивных, экологически безопасных, устойчивых систем сельского хозяй-
ства [20–23 и др.].

В теории стабилизации микробно-растительных систем, создан-

ной российскими учеными, описаны механизмы функциональной инте-
грации микроорганизмов и растений, создающие системы адаптации, 
которые не существовали у партнеров до их объединения [24–28]. 
В данном случае речь идет о создании методов и технологий формиро-
вания, поддержания и эффективного функционирования высокоинте-
грированных микробно-растительных систем, которые должны обла-
дать максимальной степенью самодостаточности, поскольку сочетают 
в себе полезные свойства не только растений, но и микроорганизмов, 
возникающих только в процессе их взаимодействия. По некоторым дан-
ным, изоляты, выделенные из ризосферы, обладают высоким коэффи-
циентом сродства к корням определенных видов растений, способно-
стью к их колонизации [29]. Причем гомологичные штаммы обладают 
большей специфичностью и более активно колонизируют корневую 
зону растений.

Имеющиеся фундаментальные знания в области микробиологии 

почвы и взаимодействия микроорганизмов и растений, а также накоп-
ленный опыт использования адаптированных к местным условиям мик-
роорганизмов на практике позволяют предложить новые подходы для 
повышения устойчивости агроэкосистем. 

Таким образом, биологическое направление в создании препара-

тов для улучшения плодородия постоянно развивается, появляются но-
вые перспективные организмы для создания на их основе биопрепара-
тов различного действия.

Фиксация азота микроорганизмами в ризосфере и ризоплане 

растений

Азот – один из основных биогенных элементов, входящих в со-

став белков и нуклеиновых кислот. Несмотря на высокое содержание 

азота в атмосфере Земли (около 78 %), он не является доступным для 
ассимиляции растениями, пока не будет преобразован в аммиак, а это
требует значительного количества энергии из-за стабильности тройной 
связи в N2. Дефицит азота в почве приводит к использованию большого 
количества азотных удобрений, чтобы восполнить потребности расте-
ний для достижения их максимальной урожайности [30].

Почвы, где сконцентрирована основная масса микроорганизмов, 

играют роль глобального биогеохимического реактора, снабжающего 
биосферу доступными соединениями азота. Круговорот азота – биогео-
химический цикл (рис. 1). Значительная его часть обусловлена дей-
ствием живых существ. Очень большую роль в круговороте играют поч-
венные микроорганизмы, обеспечивающие азотистый обмен почвы – кру-
говорот в почве азота, который присутствует там в виде простого веще-
ства (газа N2) и ионов: нитритов (NO2-), нитратов (NO3-) и аммония
(NH4+). Концентрации этих ионов отражают состояние почвенных со-
обществ, поскольку на эти показатели влияет состояние биоты (расте-
ний, микрофлоры), состояние атмосферы, вымывание из почвы различ-
ных веществ. Они способны снижать концентрации азотсодержащих 
веществ, губительные для других живых организмов, а также перево-
дить токсичный для живых существ аммиак в менее токсичные нитраты 
и в биологически инертный атмосферный азот [31]. Следовательно, 
микрофлора почвы способствует поддержанию стабильности ее хими-
ческих показателей.

Азотфиксирующие прокариоты являются основными поставщи-

ками связанного азота, так как только они одни из всего населения 
Земли обладают уникальной способностью к усвоению молекулярного 
азота – диазотрофии.

Физиологическая активность прокариот в 100–1000 раз выше, 

чем у эукариот (растений и животных) вследствие значительно более 
высокого соотношения между поверхностью и объемом. Они осуществ-
ляют свои функции в широких пределах температуры, кислотности, со-
лености. Прокариоты отличаются от других организмов максимально 
высокой скоростью размножения и способностью достичь предельной 
численности за короткий промежуток времени. Совокупность этих 
свойств позволяет им осуществлять функции глобального азотного ре-
актора, за счет деятельности которого в биосфере возникают и с разной 
длительностью присутствуют разнообразные азотсодержащие соединения (
от предельно восстановленных до предельно окисленных), обеспечивая 
все другие организмы азотом в необходимой им форме.

Атмосферный азот N2

Денитрификация
Азотфиксация

Нитраты восстанавливают до газообразного 
азота бактерии, главным 
образом рода Pseudomonas

Атмосферный азот
фиксируют 

бактерии родов Azotobacter, Clos-
tridium, Rhizobium, цианобакте-
рии и другие микроорганизмы, 
затем N2 используют растения и 
превращают его в растительный 
белок, растения поедают животные – 
образуется животный белок 
и т.д.

Нитрификация

Аммонификация

Аммиак окисляют до нитратов 
бактерии рода Nitrosomonas, а 
нитриты до нитратов – бактерии
рода Nitrobacter

Белки животных и растительных 
остатков разлагают в почве микроорганизмы, 
например, родов 
Pseudomonas, Bacillus, Clostrid-
ium. В результате образуются 
аминокислоты, затем дезамини-
рующиеся с выделением NН3 и 
других соединений

Рис. 1. Превращение микроорганизмами соединений азота [31]

Биологическая фиксация азота атмосферы остается проблемой, 

значение которой возрастает и выходит далеко за рамки биологии и 
сельского хозяйства. Причин тому много: производство минеральных 
удобрений потребляет до трети энергии, выделяемой на сельское хозяй-
ство в развитых странах, в том числе и в Российской Федерации (РФ), а 
применение ведет к серьезному загрязнению окружающей среды, ухуд-
шению качества сельскохозяйственной продукции, росту заболеваемо-
сти и смертности людей и животных, снижению почвенного плодоро-
дия [24, 32, 33].

Микробная азотфиксация играет ключевую роль в балансе азота 

в биосфере и по своей значимости для живой природы сравнима только 
с другим глобальным процессом – фотосинтезом [34]. При активизации 
биологической фиксации азота в растения поступает дополнительно 
20–30 кг минеральных азотных удобрений. Кроме того, повышается 
продуктивное использование растениями азота удобрений из почвы, а 
также снижаются потери азота.

Дополнительным источником азотного питания культурных рас-

тений может быть использование биологического потенциала азотфик-
сирующих микроорганизмов, способных обеспечить доступным азотом 
не только себя, но и население планеты. Поэтому среди различных 
форм микробной азотфиксации основное значение в биосфере имеет ас-
социативная.

Согласно современным представлениям несимбиотические ди-

азотрофы – это микроорганизмы, образующие ассоциации на корнях 
небобовых растений. При этом создается целостная система, способная 
часть энергии фотосинтеза направлять на процесс превращения атмо-
сферного азота в доступные для растения азотистые соединения. Ассо-
циативные микроорганизмы обладают многочисленными функциями: 
они способны увеличивать растворимость почвенных фосфатов, проду-
цировать физиологически активные вещества, ингибировать развитие 
патогенной микрофлоры через выделение антибиотиков, стимулиро-
вать прорастание семян и др. [24, 35–38].

Активность азотфиксации сопряжена с фотосинтетической дея-

тельностью [39]. Установлено, что уровень активности фотосинтеза 
многих растений вызывает активизацию ризосферных микроорганиз-
мов, обеспечивая их комплексом веществ, необходимых для оптималь-
ного осуществления процессов их жизнедеятельности. 

Особенности видового состава и количества микроорганизмов за-

висит от растения. В табл. 1 приведены данные литературы о численно-
сти диазотрофов в ризосфере различных сельскохозяйственных расте-
ний.

К настоящему времени диазотрофия обнаружена практически у 

всех групп прокариот – у фототрофов, хемолитотрофов и гетеротрофов, 
у аэробов, анаэробов и микроаэрофилов, у трихомных, почкующихся и 
мицелиальных микроорганизмов, у эубактерий и архей [14, 15, 17, 19, 
34 и др.].

Таблица 1

Численность диазотрофных микроорганизмов 
в ризосфере сельскохозяйственных культур [24]

Растение
Диазотрофы
Численность,

×103 КОЕ/ г почвы

Овес
Azotobacter
45,0

Пшеница
Azospirillum
2,0

Пшеница
Azospirillum
99,0

Пшеница
Azotobacter
0,1

Кукуруза
Azotobacter
25,0

Кукуруза
Azotobacter
2500,0

Сахарная свекла
Azotobacter
5,0

Амарант
Azotobacter,
Azospirillum
1800,0–12800,0

При биологической фиксации азота увеличивается урожай после-

дующей культуры в севообороте, улучшается плодородие почвы. По-
этому ассоциативные азотфиксаторы относятся к числу агрономически 
значимых групп, а прикорневая зона растений является наиболее благо-
приятной средой для их размножения. 

Очевидно, что именно ассоциативные диазотрофы, развивающи-

еся в ризосферном симбиозе с зерновыми, кормовыми культурами 
представляют наибольший интерес для исследователей, поскольку они 
могут служить переходными формами к созданию азотфиксирующих 
симбионтов важнейших сельскохозяйственных растений. 

Значимость почвенных фосфатмобилизующих 

микроорганизмов

Кларк минерального фосфора – одного из главных элементов, не-

обходимых для роста и развития растений, в земной коре невысокий 
(около 0,1 %). В свободном состоянии фосфор в литосфере не встреча-
ется, он вовлекается в глобальную циркуляцию путем выщелачивания 
и растворения континентальными водами. 

В настоящее время проблема фосфора в земледелии является од-

ной из самых острых, так как фосфор находится в почве в основном в 
водонерастворимой форме в виде разнообразных минеральных соеди-
нений, в основе которых лежат ортофосфаты кальция, железа и