Флуоресцентная IN SITU гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факультетов университетов)

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ IN SITU  
ГИБРИДИЗАЦИЯ В ПРАКТИКЕ  
НАУЧНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ  
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 

(для студентов биологических  
и медицинских факультетов университетов)

Учебно-методическое пособие

Санкт-Петербург 
Издательство РГПУ им. А. И. Герцена 
2021

РоССИйСкИй  ГоСУдАРСтвенный  
ПедАГоГИчеСкИй  УнИвеРСИтет  им.  А. И. ГеРценА

 
© А. Ф. Сайфитдинова, И. Л. Пуппо, составители, 2021
© Издательство РГПУ им. А. И. Герцена, 2021
© С. В. Лебединский, оформление обложки, 2021
ISBN  978-5-8064-2984-2

ББК 28.04я73
Ф 69

Ф 69     Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных 
и клинических цитогенетических исследований (для студентов 
биологических и медицинских факультетов университетов). — 
Санкт-Петербург : Изд-во РГПУ им. А. И. Герцена, 2021. — 60 с.
ISBN  978-5-8064-2984-2
Учебно-методическое пособие содержит описание методов физической локализации последовательностей ДНК на хромосомах на основе гибридизации нуклеиновых кислот in situ для решения фундаментальных и прикладных задач. Дается описание принципа метода FISH и история его создания. Представленная 
информация изложена в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта и основана на последних достижениях современной науки,  
а также на собственном опыте авторов в развитии и применении FISH. Пособие 
содержит подробные протоколы с описанием методических особенностей для 
практического применения в различных научных и клинических цитогенетических 
исследованиях, вопросы и задания для контроля освоения материала. 
Пособие предназначено для студентов биологических и медицинских факультетов университетов, а также медицинских и педагогических институтов, аспирантов и специалистов, использующих гибридизацию in situ в научных исследованиях и диагностике.
ББК 28.04я73

Р е ц е н з е н т ы: 
канд. биол. наук О. Г. Чиряева (Федеральное государственное бюджетное научное 
учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии  
и репродуктологии им. Д. О. Отта») 
канд. биол. наук А. М. Злотина (Федеральное государственное бюджетное 
учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени  
В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации)

С о с т а в и т е л и: 
канд. биол. наук А. Ф. Сайфитдинова 
канд. биол. наук И. Л. Пуппо

Печатается по решению кафедры анатомии и физиологии  
человека и животных РГПУ им. А. И. Герцена

Утверждено в качестве учебно-методического пособия на заседании  
учебно-методического совета ФГБУ НМИЦ им В. А. Алмазова

ОГЛАВЛЕНИЕ

Гл а в а  1 
ПРИНЦИП ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ . . .  
5
Вопросы для самостоятельного контроля . . . . . . . . . . . . . . . .  20

Гл а в а  2 
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА FISH В ПРАКТИКЕ НАУЧНЫХ  
И КЛИНИЧЕСКИХ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ  21
2.1. Методики приготовления препаратов для in situ  
гибридизации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  22
2.1.1. Методика приготовления препаратов метафазных 
хромосом и интерфазных ядер из лимфоцитов 
периферической и пуповинной крови человека . . . . . . . .  22
2.1.2. Методика приготовления препаратов метафазных 
хромосом и интерфазных ядер из клеток  
культивированных фибробластов человека. . . . . . . . . . . .  24
2.2. Протоколы приготовления и мечения зондов . . . . . . . . . . . .  26
2.2.1. Протокол 1. Мечение ДНК-зондов методом никтрансляции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  26
2.2.2. Протокол 2. Оптимизация размеров меченых  
фрагментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  27
2.2.3. Протокол 3. Олигомечение ДНК со случайными 
праймерами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  28
2.2.4. Протокол 4. Мечение зондов методом ПЦР. . . . . . . . . .  29
2.2.5. Протокол 5. Очистка ПЦР продукта. . . . . . . . . . . . . . . .  30
2.2.6. Протокол 6. Получение меченых РНК зондов. . . . . . . .  31
2.2.7. Протокол 7. Оценка эффективности мечения зонда . . .  32
2.3. Метафазная и интерфазная in situ ДНК гибридизация . . . . .  33
2.4. Несколько туров in situ ДНК гибридизации на одном  
препарате . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  40
2.5. Интерпретация полученных результатов после FISH  
по протоколу ДНК гибридизации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  40

2.6. Детекция РНК на цитологических препаратах с помощью  
FISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  43
2.6.1. Детекция транскриптов на кусочках ткани или целых 
эмбрионах (whole mount FISH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  43
2.6.2. Детекция транскриптов на криосрезах . . . . . . . . . . . . .  46
2.6.3. Детекция транскриптов в культуре клеток . . . . . . . . . .  47
2.6.4. Контрольные эксперименты при постановке РНК FISH  48
Вопросы для самостоятельного контроля . . . . . . . . . . . . . . . .  49
2.7. Приложения к главе 2  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  49

Гл а в а  3 
ПРАВИЛА ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТА FISH ИССЛЕДОВАНИЯ . . . .  51
Задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  54
Ответы на задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  56

Словарь терминов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  57

Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  59

Гл а в а  1 
 
ПРИНЦИП ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ  
IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ 

Разработанный Дж. Голлом и М.-Л. Пардью в 1969 г. на основе 
свойства нуклеиновых кислот комплементарно спариваться, метод 
гибридизации in situ позволяет точно определить локализацию практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно 
в клетке или клеточном ядре, на метафазных хромосомах, растянутых 
хроматиновых фибриллах и микроматрицах благодаря использованию 
высокочувствительной флуоресцентной микроскопии. Особую востребованность методы гибридизации in situ приобрели в последнее 
время в связи с развитием персонализированной таргетной биомедицины. В последние 30 лет технология флуоресцентной in situ 
гибридизации (FISH) интенсивно развивалась и преобразовалась в 
целый комплекс методов, позволяющих получать информацию не 
только о физической локализации нуклеиновых кислот, но и об организации генома и кариотипа. Различают FISH на растянутых 
фибриллах, на метафазных хромосомах, на распластанных интерфазных ядрах и на фиксированных препаратах клеток, сохраняющих 
трехмерную организацию (3D-FISH). В зависимости от особенностей 
исследования и решаемых им задач выделяют следующие разновидности: одновременную многоцветную FISH с использованием различных зондов, многоцветную FISH с зондами к отдельным хромосомным сегментам (M-FISH), многоцветный бэндинг хромосом 
(MCB-FISH), хромосомный пэйнтинг (Zoo-FISH), межвидовое цветное сегментирование хромосом (Rx-FISH), спектральное кариотипирование (SKY), супрессорную FISH в присутствии избыточного 
количества конкурентной ДНК (CISS), сравнительную геномную 
гибридизацию (CGH). Несмотря на различия отдельных протоколов, 
все они включают этапы денатурации меченого зонда и нуклеиновых 
кислот на препарате с последующей их одновременной ренатура цией 
двойной спирали (рис. 1). 
В качестве зонда, в любой разновидности гибридизации in situ, 
используются фрагменты нуклеиновых кислот, в состав которых 
включены репортерные молекулы. Прямое мечение осуществляется 

включением предшественников нуклеиновых кислот, непосредственно конъюгированных с красителем. Обычно для этого используют 
органические флуорохромы на основе химически модифицированных 
родаминов или цианинов, т. к. они обладают хорошими спектральными характеристиками и стабильностью в водных растворах. Для одновременной многоцветной FISH зонды метят флуорохромами, спектры 
которых не перекрываются. В некоторых случаях, краситель вводят в 
состав зонда методами твердотельного химического синтеза, однако 
наиболее распространены методы биохимического синтеза на основе 
различных полимеразных реакций. Для непрямого мечения используются предшественники, несущие химические модификации, не препятствующие биохимическому синтезу нуклеиновых кислот, такие 
как биотин, дигоксигенин, динитрофенол, эстрадиол, а также этинил. 
Используют дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, связанные ковалентно с репортерной молекулой углеводородным линкером для облегчения включения такого предшественника в синтезируемый зонд. 
На препаратах такие репортерные молекулы (биотин, дигоксигенин, 
динитрофенол, эстрадиол) детектируют веществами, имеющими к ним 
высокое сродство, например различными вариантами авидина для 
детекции биотина или специфичными антителами. Для визуализации 
используют хромогенные или флуоресцентные красители. Этинилированные предшественники выявляют проведением на препарате так 
называемой клик-реакции, которая происходит при комнатной температуре в водной среде в присутствии медного катализатора между 
этинилом в составе зонда и азидной группой, функционализирующей 
краситель. 
Состав и размеры зондов варьируют в зависимости от целей эксперимента и особенностей метода. Последовательность, комплементар
Рис. 1. Схема гибридизации нуклеиновых кислот in situ с использованием 
меченого зонда (репортерная молекула обозначена звездочкой)

ная исследуемой, может быть представлена РНК, одно- и двунитевой 
ДНК, а также искусственными аналогами, или ксенонуклеиновыми 
кислотами, несущими в своем составе химические модификации, 
не существующие в природе, однако сохраняющие информационные 
свойства нуклеиновых кислот. Длина зонда может колебаться от 20– 
40 п.н. вплоть до 1000 п.н. Каждый вариант имеет свои преимущества 
и недостатки. Рассмотрим их более подробно. Чаще всего используются двунитевые ДНК зонды, устойчивые к внешним воздействиям, 
которые можно успешно метить различными способами, однако они 
требуют обязательной денатурации перед использованием. Однонитевые ДНК зонды не требуют денатурации, но если для их получения 
используют метод ПЦР с праймером к антисмысловой цепи, то эффективность такой реакции значительно ниже, поскольку количество 
продукта увеличивается в арифметической прогрессии, тогда как при 
использовании двух праймеров нарастание происходит в геометрической прогрессии. Недостатком ДНК-зондов является то, что они  
с трудом проникают внутрь толстых объектов. В этом случае предпочтительнее использование РНК зондов, которые получают методом 
транскрипции in vitro в присутствии меченых предшественников. 
Такие зонды имеют высокое удельное включение модифицированных 
предшественников, а, кроме того, позволяют легко удалять с препарата несвязавшиеся однонитевые молекулы РНК простым перевариванием РНКазой А. Однако они чувствительны к действию РНКаз на 
всех этапах гибридизации, что накладывает дополнительные требования к работе с ними. Легко проникают внутрь любых образцов и устойчивы к действию РНКаз синтетические олигонуклеотидные пробы,  
но из-за технологических сложностей длина их ограничена, поэтому 
работать с ними приходится при низких температурах, иначе есть риск 
полностью отмыть весь зонд с препарата. 
Использование в качестве зондов для FISH ксенонуклеиновых 
олигонуклеотидов, несущих в своем составе отдельные основания 
замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК), которые включаются в полипептидную цепь также как и природные нуклеиновые основания, 
позволяет повысить их устойчивость (рис. 2). Кроме того, структурная 
особенность входящей в их состав замкнутой рибозы увеличивает 
жесткость сахарного остова полимера, что не позволяет такому олигонуклеотиду сворачиваться и повышает температуру плавления дуплекса. Это свойство позволяет уменьшить эффективную длину зондов 
и повысить специфичность гибридизации. 

Практически не имеют недостатков зонды на основе пептиднонуклеиновых кислот (ПНК), которые представляют собой линейные 
полимеры синтетических амидов, несущих азотистые основания, 
связанных в цепь пептидной связью. За счет сходства по размеру 
с мономером нуклеиновой кислоты такие полимеры могут комплементарно взаимодействовать с природными нуклеиновыми кислотами, 
однако они устойчивы к ферментам. Отсутствие отрицательного заряда оси таких полимеров дает им преимущества при формировании 
дуплексов с заряженными природными молекулами, благодаря чему 
они легко проникают в ткани, а также обладают способностью взаимодействовать с двунитевой ДНК на препарате, комплементарно связываясь с одной нитью ДНК и вытесняя другую из дуплекса, что делает 
ненужным предварительную денатурацию ДНК образца. Однако такие 
зонды нельзя получать и метить в лабораторных условиях, а заказ и 
приобретение их у фирм-изготовителей требует существенных материальных затрат. 
В зависимости от типа мишени, зонды можно разделить на следующие группы:
• специфично окрашивающие целые хромосомы (хромосомные 
пэйнты),
• специфично окрашивающие отдельные плечи хромосом или хромосомные сегменты,
• маркирующие центромеры отдельных хромосом (последовательности альфа-сателлитов),
• маркирующие районы локализации других сателлитных последовательностей,

Рис. 2. Варианты основания ЗНК, в которых замыкание рибозы  
осуществляется с участием различных химических соединений

• окрашивающие теломерные последовательности,
• маркирующие субтеломерные районы отдельных хромосом,
• маркирующие конкретные локусы хромосом (на основе клонированных последовательностей генома, отдельных генов или их 
фрагментов). 
В качестве зондов могут выступать как белок-кодирующие, так  
и некодирующие последовательности. В зависимости от задач исследования используют разные виды зондов или их комбинацию.
Определившись с типом зонда и выбрав подходящую метку, необходимо произвести включение меченого предшественника в состав 
зонда. Самым дешевым методом, позволяющим пометить любую 
двунитевую ДНК, является метод ник-трансляции. Поскольку процесс 
мечения определяется одновременной работой двух ферментов —  
ДНКазы I, наносящей однонитевые разрывы, и ДНК полимеразы I, 
обладающей 5’–3’ экзонуклеазной и полимеразной активностями, успех 
мечения в значительной степени зависит от качества очистки исходной 
ДНК и предварительного тестирования активности ферментов.
Концевое мечение с использованием дезоксинуклеотидил трансферазы применяется главным образом для включения радиоактивного предшественника или мечения олигонуклеотидных зондов. В настоящее время вместо этого метода чаще используют твердотельный 
химический синтез с включением метки на одном из концов олигонуклеотида, который дает более уверенное включение и дешевле  
в производстве.
Метод олигомечения со случайными праймерами основан на использовании коротких олигонуклеотидных (6–9 п.н.) затравок, с равной вероятностью отжигающихся вдоль всей денатурированной молекулы ДНК и способности фрагмента Кленова ДНК полимеразы I  
к 5’–3’ полимеразной активности. Он позволяет получать зонды с 
большей долей включения меченого предшественника, чем концевое 
мечение и ник-трансляция, но длина меченых фрагментов может быть 
ограничена только длиной матрицы, что не всегда удобно, а, кроме 
того, себестоимость зонда, полученного таким образом, выше. Тем не 
менее, этот метод достаточно прост и пользуется популярностью. При 
необходимости мечения этим методом сложных матриц, обогащенных 
вторичными структурами, используют изотермический вариант этого 
метода с полимеразами, обладающими геликазной активностью (например, большой субъединицы полимеразы BstI или полимеразы 
бактериофага Ф29). В этом случае важно осуществлять контроль  

за длиной образовавшихся фрагментов и проводить предварительную 
фрагментацию матрицы химическими или физическими методами,  
в зависимости от особенностей нуклеотидной последовательности.
Наиболее дешевым и вместе с тем самым эффективным методом 
получения меченых ДНК зондов является метод ПЦР. Кроме высокой 
эффективности включения меченых нуклеотидов, этот метод позволяет увеличить количество исходной матрицы в среднем в 104 раз. 
При необходимости получить зонд для локализации известной последовательности используются праймеры, находящиеся на расстоянии 
100 п.н. — 1000 п.н., не образующие шпилек и не комплементарные 
друг другу. При использовании в качестве матрицы геномной ДНК 
рекомендуется до реакции мечения получить первичный амплификат 
и убедиться, что его длина соответствует предполагаемой. Дополнительно желательно провести секвенирование полученного фрагмента 
по Сэнгеру, чтобы убедиться в его соответствии ожидаемому по нуклеотидному составу. В том случае, если необходимо получить зонд 
для клонированного фрагмента неизвестной нуклеотидной последовательности, можно воспользоваться стандартными праймерами, 
фланкирующими полилинкерный участок вектора. Необходимо помнить, что наилучший результат получается при использовании зондов 
длиной 200–700 п.н., при этом допустимо использование последовательностей до 1000 п.н., но если клонированный фрагмент длиннее, 
его придется разрезать подходящей рестриктазой или ДНКазой I. Для 
этого готовят раствор 1,5 мкг/мл ДНКазы; 0,1M MgCl2 и добавляют 
прямо в реакционную смесь в таком количестве, чтобы после 10–15 мин 
инкубации в растворе были фрагменты длиной 200–500 п.н. Ингибируют ДНКазу прогреванием в течение 2–3 мин при 94оС.
Использование ПЦР с вырожденными праймерами позволяет метить 
любые последовательности ДНК достаточно эффективно, причем, 
имея даже незначительное число копий исходной ДНК-матрицы, мы 
можем получить неограниченное количество меченого зонда. Сначала проводят несколько низкотемпературных циклов, позволяющих 
праймерам фланкировать участки ДНК матрицы, причем, варьируя 
условия первых циклов можно задавать специфичность отжига и 
длину полученных фрагментов. В следующих высокотемпературных 
циклах полученные фланкированные последовательности амплифицируются по стандартному протоколу ПЦР. Меченый предшественник 
вводится в реакцию только после проверки длины первичного амплификата. 1–10 мкл исходного ПЦР продукта берут в реакцию мече

ния и проводят ее только с использованием высокотемпературных 
циклов. В зависимости от конкретных задач и особенностей объекта 
используются разные типы вырожденных праймеров, отличающихся 
по спектру амплифицируемых последовательностей. Праймеры Тиле - 
ниуса (5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’), внутренняя последовательность которых состоит из 6 случайных нуклеотидов и метионинового кодона при полногеномной амплификации у высших эука- 
риот насыщают амплификат последовательностями мобильных эле- 
ментов. Праймеры к микросателлитам (5’-TTGTGTTGGGTGTGTTTGG) 
позволяют получать более равномерную амплификацию, однако они 
не позволяют избежать насыщения амплификата повторяющимися 
последовательностями. Для повышения доли уникальных последовательностей используют праймеры, образующие дуплексы сами с собой 
(5’-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG), что позволяет во 
время низкотемпературных циклов формировать петли и избегать 
повторной амплификации. Новые возможности в получении зондов 
открыли методы изотермической амплификации, основанные на использовании полимераз с геликазной активностью. В этом случае 
используют гексануклеотидные случайные праймеры, но перед использованием в качестве зондов такие амплификаты необходимо 
обработать нуклеазой S1 или S7 для получения зондов эффективной 
длины и разрешения сложных ветвящихся полимерных дуплексов.
Очистить полученный зонд от минерального масла (если оно использовалось), а также избавиться от невключившихся нуклеотидов 
можно переосаждением амплификата изопропанолом.
Однонитевые РНК зонды получают методом транскрипции in 
vitro. Для этого используются векторы с промоторами для различных 
фаговых РНК-полимераз, причем наличие разных промоторов по 
обеим сторонам клонированного фрагмента позволяет получать 
однонитевые зонды, комплементарные как смысловой, так и несмысловой последовательности. Это дает возможность осуществления 
контрольного эксперимента. Чтобы исключить получение длинных 
последовательностей, содержащих не только клонированный фрагмент, вектор разрезают рестриктазой по сайту, находящемуся сразу 
за вставкой, после чего линейную последовательность проверяют 
методом электрофореза и дважды очищают фенол-хлороформом. 
Очищенный линейный вектор переосаждают спиртом и растворяют 
в 10мМ Tris-HCl (pH 8,0); 1мМ ЭДТА. Метить РНК можно непосредственно предшественником, несущим репортерную молекулу, 

но эффективность включения выше при использовании смеси UTP 
и аминоаллил-UTP (1:1), с последующим присоединением биотина 
к уже синтезированной молекуле РНК.
Эффективность включения модифицированного предшественника 
в состав зонда можно оценить иммунохимической реакцией с антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой.
Количество меченого зонда, необходимое для проведения одной 
гибридизации, зависит не только от удельного включения модифицированного предшественника, но и от состава исследуемой последовательности. При этом одновременно надо учитывать, что для создания 
условий, благоприятствующих выходу денатурированного зонда из 
раствора и образованию гибридных двунитевых структур с нуклеиновыми кислотами на препарате, необходимо повысить тотальную 
концентрацию ДНК в растворе. Для этого используют ДНК или РНК 
носитель. В некоторых случаях вместо носителя используют конкурентную ДНК, которая комплементарно связывает часть меченого 
зонда, выводя его таким образом из реакции гибридизации с нуклеиновыми кислотами на препарате. От того, выполняет ли носитель роль 
конкурентной ДНК помимо повышения концентрации ДНК в реакционной смеси, также зависит, сколько меченого зонда необходимо 
использовать в одной реакции гибридизации.
Для локализации уникальных последовательностей на один препарат необходимо взять 50–100 нг зонда в 10 мкг ДНК носителя, 
представляющую собой чужеродную ДНК, не имеющую комплементарных участков к исследуемой последовательности. Чаще всего для 
этой цели используют фрагментированную ДНК спермы лосося (размер фрагментов от 400 до 1000 п.н.). В том случае, если вы собираетесь 
исследовать последовательности в геноме лосося, придется выбрать 
другой тип носителя, которым может быть ДНК любого эволюционно 
удаленного вида.
Для локализации повторяющихся последовательностей, в частно - 
сти сателлитной ДНК или рибосомных генов на один препарат берут 
20–50 нг зонда в 10 мкг носителя, которым может быть любая ДНК, 
не имеющая комплементарных участков с исследуемой. Для рибосомных генов и теломерных последовательностей лучше использовать  
в качестве носителя тРНК, но не для генов 5S рРНК, так как они имеют участок значительной гомологии с последовательностью тРНК.  
В этом случае в качестве носителя можно взять линеаризованную 
плазмидную ДНК.