Руководство по изучению цитологических и гистологических характеристик культур клеток и тканей растений

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ  
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 
Биологический институт 
 
 
 
 
 
 
М.В. Филонова, С.В. Пулькина, А.А. Чурин,  
Т.И. Фомина, Ю.В. Медведева  
 
Руководство по изучению  
цитологических и гистологических 
характеристик культур клеток  
и тканей растений 
 
 
Учебное пособие 
 
 
 
 
 
 
 
Томск 
Издательский Дом Томского государственного университета 
2020 
 

УДК 581.143.6 
ББК 28.57 
        Ф552 
 
Филонова М.В., Пулькина С.В., Чурин А.А.,  
Фомина Т.И., Медведева Ю.В. 
Ф552 
Руководство по изучению цитологических и гистологических 
характеристик культур клеток и тканей растений : учеб. пособие. – Томск : Издательский Дом Томского государственного 
университета, 2020. – 74 с. 

ISBN 978-5-94621-889-4 
 
В учебном пособии рассмотрены теоретические основы и методические 
приемы получения, культивирования, а также изучения цитологических и гистологических характеристик культур клеток и тканей растений. Каждая тема 
пособия содержит теоретическую часть, подробные планы лабораторных работ, 
в конце темы приведены контрольные вопросы.  
Для студентов Биологического института ТГУ, обучающихся по специальности «биология» 06.03.01 бакалавров и 06.04.01 магистров, изучающих курсы 
«Методы цитологических исследований», «Биотехнология растений», «Биотехнология лекарственных и ароматических растений», а также разделы большого 
практикума по цитологии и культурам клеток и тканей растений. Может быть 
полезно аспирантам, преподавателям вузов и исследователям, интересующимся 
культурами клеток и тканей растений. 
 
УДК 581.143.6 
ББК 28.57 
 
Рецензенты: 
М.В. Олонова, доктор биологических наук, профессор, БИ НИ ТГУ; 
Е.В. Удут, доктор медицинских наук, профессор РАН,  
зав. ЦНИЛ ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России 
 
 
 
 
 
 
 
© Филонова М.В., Пулькина С.В., Чурин А.А.,  
Фомина Т.И., Медведева Ю.В., 2020 
ISBN 978-5-94621-889-4 
© Томский государственный университет, 2020 

СОДЕРЖАНИЕ 

Предисловие .............................................................................. 4 

Тема 1. Подготовительные процедуры .................................... 5 

Тема 2. Питательные среды .....................................................12 

Тема 3. Стерилизация растительного материала ....................24 

Тема 4. Культура каллусных тканей .......................................28 

Тема 5. Культура клеточных суспензий ..................................32 

Тема 6. Методы оценки роста культур клеток и тканей 
растений ...................................................................................35 

Тема 7. Цитологические и цитогенетические характеристики 
клеточных культур ...................................................................44 

Тема 8. Гистологическое исследование культур клеток  
и тканей растений ....................................................................63 

Литература ...............................................................................73 

 

ПРЕДИСЛОВИЕ 
 
Культуры клеток и тканей растений представляют собой популяции клеток, выращиваемые в искусственных условиях и 
обладающие уникальными свойствами. Эти свойства позволяют 
выращивать культуры клеток растений в специальных условиях 
в виде клеточной массы в форме каллусной или суспензионной 
культур. Культуры in vitro являются экспериментально созданной биологической системой и могут использоваться в качестве 
модели в физиологии, биохимии и генетике растений, а также 
как инструмент для разнообразных биотехнологических исследований. Клеточные культуры растений способны к синтезу 
специфических промышленно важных биологически активных 
веществ, которые могут заменить соединения, получаемые из 
растительного сырья in vivo. 
Кроме сферы получения специфических химических соединений, клеточные культуры широко используются для экспериментальной разработки принципиально новых технологий, которые основаны на манипуляциях с отдельными клетками. Среди них можно упомянуть методы гибридизации соматических 
клеток, получение трансгенных растений с необходимыми признаками, получение мутантов in vitro и т.д. В процессе культивирования с применением различных методов биотехнологии 
можно получить растения с новыми свойствами. 
Методы биотехнологии высших растений широко используются для решения фундаментальных вопросов биологии растений и для развития биотехнологии в целом.  
 
 

Тема 1. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ 
 
Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы. 
Оборудование: дистилляторы, холодильники, термостаты, 
сушильные шкафы, аналитические и торсионные весы, магнитные мешалки, электроплитки, автоклав и ламинар-боксы, шейкеры, микроскопы, компьютеры, микротом, кондиционер для 
регуляции температуры (25±2°C) и влажности воздуха (70%), а 
так же стеллажи, оборудованные лампами со спектром, близким 
к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), фитотроны и др.  
Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в 
биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, стеклянные бутылки, культуральные баночки, пипетки, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, 
стеклянные и мембранные фильтры, скальпели, ножницы, пинцеты, препаровальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля. 
 
Общие правила при проведении опытов 
 
1. Студентам запрещается работать в лаборатории в отсутствие преподавателя или лаборанта, а также в неустановленное 
время.  
2. В лабораторию запрещается входить в верхней одежде и 
класть на столы личные вещи. 
3. В биотехнологической лаборатории разрешается работать 
только в халатах, волосы необходимо закалывать либо убирать 
под шапочку. 
4. Перед тем как приступить к работе, необходимо прочитать 
и проработать методику и правила ее безопасного выполнения; 

подготовить соответствующие материалы, приборы и реактивы 
для выполнения работы. 
5. Опыт необходимо проводить в точном соответствии с его 
описанием в методических указаниях, особенно придерживаться 
очередности добавления реактивов. 
6. Контрольный опыт всегда необходимо проводить одновременно и при тех же условиях, что и основной. Оба варианта 
должны отличаться только одним единственным признаком. 
7. Опыты необходимо производить в нескольких вариантах. 
Разница между двумя вариантами считается статистически достоверной только тогда, когда она в 3 раза больше средней ошибки. 
8. Необходимо вести аккуратную и точную запись (протокол) 
проведения опыта и результатов. Записи располагаются в определенном порядке и в таком же порядке сохраняются. Форма 
для составления отчета представлена ниже. 
9. Аппараты, приборы и посуду следует всегда держать в чистоте, а рабочее место – в порядке.  
10. Взвешивание реактивов и исследуемого материала осуществляют на предварительно тарированной подложке (кальке 
или бумаге для взвешивания). 
11. Реактивы из банок, в которых они хранятся, берут чистой 
ложечкой или шпателем, которые после использования необходимо вымыть и высушить.  
12. При работе с гигроскопичными веществами емкости / сосуды после их использования немедленно закрывают 
пробками и при необходимости плотно обертывают парафильмом для предотвращения попадания влаги. 
13. При длительных наблюдениях над местом опыта вывешивают информационный лист, в котором отмечают продолжительность и характер опыта, а также фамилию экспериментатора 
и его контактные данные для связи. 
14. При проведении всех цитологических и гистологических 
экспериментов необходимо использовать один и тот же микроскоп, одно и то же увеличение и одну и ту же компьютерную 
программу анализа. 

15. По окончании работы следует привести в порядок свое 
рабочее место: помыть посуду, протереть поверхность лабораторного стола, закрыть водопроводные краны, выключить электрические приборы. 
 
Техника безопасности 
 
1. Работу с автоклавом и сухожаровыми шкафами (включение и выключение) осуществляют только преподаватель или 
лаборант.  
2. Электроплитки при использовании должны стоять на теплоизолирующей, огнестойкой подставке (керамическая плита). 
3. При неисправности в работе электроприбора (например, 
подсветка в микроскопе) необходимо обратиться к преподавателю. Чинить самостоятельно любые приборы запрещается. 
4. Многие виды работ требуют использования спиртовки, перед началом работы со спиртовкой необходимо убедиться, что 
корпус ее не имеет трещин и дефектов, фитиль выпущен на нужную высоту и развернут, а горловина и черенок фитиля сухие. 
5. Для поджигания спиртовки необходимо использовать 
спички. Зажженную спиртовку запрещается переносить с места 
на место, а также зажигать одну спиртовку от другой. 
6. В спиртовках можно использовать только этиловый спирт, 
пользоваться бензином или другими горючими жидкостями запрещается. 
7. Тушить спиртовку нужно накрывая пламя колпачком. Запрещено задувать пламя, оставлять горящую спиртовку без присмотра. 
8. В опытах, требующих нагревания, необходимо пользоваться посудой, которая имеет соответствующую маркировку («термостойкая»). 
9. Запрещается пользоваться разбитой или треснувшей посудой.  
10. При переливании растворов необходимо использовать 
специальные химические воронки. 

11. При использовании кислот и щелочей необходимо внимательно следить за тем, чтобы реактивы не попадали на лицо, руки и одежду. Почти все кислоты и щелочи относятся к веществам повышенного класса опасности и способны вызвать химические ожоги и отравления.  
12. Пролитые на пол и стол растворы кислот и щелочей 
нейтрализуют, после чего убирают под руководством преподавателя или лаборанта в соответствии с правилами. 
13. Концентрированные / отработанные растворы кислот и 
щелочей сливают в специальную посуду. Запрещено сливать в 
раковины и канализацию! 
14. Работу с едкими, токсичными и легкоиспаряющимися 
жидкостями необходимо проводить только в вытяжном шкафу.  
15. При работе с едкими (ледяная уксусная кислота), токсичными (колхицин) и красящими веществами (азотнокислое серебро, ацетогематоксилин) следует использовать перчатки. 
16. При попадании едких веществ на кожу необходимо: если 
попала кислота – промыть пораженный участок водопроводной 
водой и нейтрализовать слабым раствором питьевой соды; если 
щелочь – промыть пораженный участок водопроводной водой и 
обработать 3–5%-ным раствором уксусной кислоты.  
17. Использованные при работе материалы, фильтры, бумагу 
следует выбрасывать в специальный контейнер. 
 
Требования к оформлению отчета 
 
Работа принимается к защите при наличии конспекта и заполненных таблиц, выводов, а также при ответе студентом на 
контрольные вопросы. 
Форма отчета 
Тема 

Цель эксперимента 

Объект исследования 

Метод исследования с подробным описанием методики и 
схемы эксперимента (в таблицах отражаются все этапы работы: 
подбираемые оптимальные условия, указываются результаты, 
полученные на каждом из этапов). 

Анализ полученных результатов в виде выводов. 

Приготовленные препараты, фотографии, рисунки. 
 
Асептика 
 

Культура растительной ткани в широком смысле относится к 

культивированию in vitro всех частей растения в асептических 
условиях. Для получения и культивирования in vitro культур 
растений требуются условия абсолютной асептики, так как 
грибная и бактериальная инфекции (выделение токсинов) ингибируют рост клеток и приводят к гибели культуры.  

Посуду, инструменты, бумагу стерилизуют в сухожаровых 

шкафах при температуре 160°C от 1,5 до 2,5 ч. Для стерилизации питательных сред, а также пластиковых материалов / инструментов (наконечники, шприцы) используют автоклав, стерилизацию осуществляют при температуре 120°C, давлении 1–
2 атм в течение 20–60 мин. Если в состав питательных сред входят термолабильные вещества, то для их стерилизации применяют бактериальные фильтры, после чего добавляют в стерильную среду, охлаждённую до температуры 40°C. 

Работу с культурами in vitro осуществляют в ламинарном 

боксе или шкафу с ламинарным потоком воздуха, проходящим 
через один или несколько фильтров HEPA (High Efficiency 
Particulate Arrestance – высокоэффективное удержание частиц), 
таким образом создавая стерильное рабочее пространство. 

Перед началом процедур рабочую поверхность ламинарного 

бокса обрабатывают 70%-ным раствором этилового спирта, помещают на столик необходимые материалы, спиртовку, посуду, 
инструменты и т.д. Далее проводиться обработка УФ

излучением в течение 15–20 мин. По окончании времени стерилизации бокса отключают УФ лампы и включают продув ламинара на 10–15 мин для удаления озона. Для работы в ламинарбоксе надевают халат и шапочку, по желанию можно работать в 
перчатках. Приступив к работе в ламинарном боксе, руки тщательно обрабатываются 70%-ным спиртом и после его испарения поджигают спиртовку, которую помещают на расстоянии 
20–25 см от переднего края ламинара. Пинцеты, скальпели и 
препаровальные иглы помещают в стакан с 96%-ным спиртом. 
Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.  
 
Лабораторная работа № 1.  
Подготовка стерильной посуды и материалов 
 
Цель – подготовить стерильную посуду и материалы, необходимые для работы с культурами in vitro 
Материалы и оборудование: сухожаровой шкаф, автоклав, 
алюминиевая фольга, бумага, фильтровальная бумага, колбы с 
дистиллированной водой, чашки Петри, баночки.  
Ход работы: 
1. Завернуть в плотную бумагу чашки Петри, баночки закрыть алюминиевой фольгой и простерилизовать сухим жаром в 
сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 160°C. 
2. Вырезать из фильтровальной бумаги матрасики диаметром, соответствующим нижней части чашки Петри и завернуть 
в плотную бумагу. В колбу налить на 2/3 части объема дистиллированную воду, горлышко закрыть фольгой, сверху – плотной 
бумагой. Автоклавировать материалы при давлении 1 атм в течение 20 мин. 
 
Контрольные вопросы по теме 
 
1. Для чего проводят стерилизацию питательных сред, материалов, инструментов, посуды? 

2. Как подготовить ламинар-бокс к работе? 
3. Каким образом стерилизуют посуду и инструменты? 
4. Как обрабатывают инструменты перед повторным использованием? 
5. Перечислите правила безопасной работы со спиртовкой. 
6. Перечислите правила безопасной работы с едкими, токсичными и легкоиспаряющимися веществами. 
7. Перечислите правила безопасной работы с электрическими 
приборами.