Клеточная терапия при нейродегенеративных заболеваниях

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский педагогический государственный университет»


А. В. Ревищин, Г. В. Павлова, В. Е. Охотин, К. А. Яковлева





КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ
ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ





Монография












МПГУ
Москва • 2017

      УДК 616.8 + 615
      ББК 56.1 + 53.53
           К487



Рецензенты:
     А. П. Рысков, чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор (Институт биологии гена РАН)
     С. А. Лимборская, доктор биологических наук, профессор (Институт молекулярной генетики РАН)


     Ревищин, Александр Владимирович.
К487 Клеточная терапия при нейродегенеративных заболеваниях : монография / А. В. Ревищин, Г. В. Павлова, В. Е. Охотин, К. А. Яковлева. - Москва : МПГУ, 2017. - 160 с.
     ISBN 978-5-4263-0553-3
     Клеточные технологии произвели революцию в области медицины за последние несколько десятилетий. В последние годы трансплантация клеток в головной и/или спинной мозг исследовалась как потенциальное средство лечения ряда заболеваний центральной нервной системы, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Геттингтона, рассеянный склероз, черепно-мозговая травма, травма спинного мозга, инсульт и ряд других состояний. Эксперименты охватывают трансплантации различных типов клеток, включая клетки, полученные и выращенные до пересадки in vitro, а также мобилизацию эндогенных стволовых клеток мозга. В течение последних двух десятилетий тема лечения на основе стволовых клеток переместилась с фундаментальной науки на перспективные доклинические и ранние клинические испытания. Ведущиеся в настоящее время клинические испытания большое внимание уделяют безопасности клеточного материала и процедур трансплантации клеток в мозг пациентов. Однако развитие клеточных технологий дают все новые варианты специализированных клеточных препаратов, которые возможно будут более эффективны для терапии, чем ныне существующие. Монография объединяет новейшие достижения в использовании клеточных технологий для лечения нейродегенеративных заболеваний. Монография рассчитана на широкий круг читателей, а также будет интересна преподавателям и студентам биологических вузов.
     Работа поддержана грантом РНФ № 14-15-00942.

                                                            УДК 616.8 + 615
                                                            ББК 56.1 + 53.53


ISBN 978-5-4263-0553-3

© МПГУ, 2017
© Коллектив авторов, 2017

        СОДЕРЖАНИЕ


Список сокращений................................................4
ВВЕДЕНИЕ ....................................................... 8
1. ОСНОВАНИЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ...................... 11
  1.1. Понятие о нейральных стволовых клетках ................. 11
  1.2. Субвентрикулярная пролиферативная зона мозга ........... 14
  1.3. Пролиферативная зона зубчатой фасции гиппокампа ........ 20
  1.4. Пролиферативные зоны в других областях взрослого мозга . 22
  1.5. Миграция в патологические очаги. Мобилизация внутренних репаративных возможностей мозга ............................. 25
  1.6. Клеточные технологии и клеточная терапия ............... 28
2. КЛЕТКИ И ВОЗМОЖНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ .......... 31
  2.1. Фетальные нейральные стволовые клетки .................. 31
  2.2. Линии нейральных стволовых клеток, полученные из фетального мозга ............................................ 36
  2.3. Ретинальные прогениторные клетки ....................... 37
  2.4. Мезенхимальные клетки взрослого организма................38
   2.4.1. Мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга ... 39
   2.4.2. Мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани .....58
  2.5. Другие соматические клетки ............................. 68
  2.6. Эмбриональные стволовые клетки (из бластоцисты) .. 68
3. ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ................... 73
  3.1. Индуцированные плюрипотентные клетки ................... 73
  3.2. Трансдифференцировка, перепрограммирование ............. 75
  3.3. Молекулярные основы перепрограммирования ............... 79
  3.4. Фармакологическое перепрограммирование ................. 81
  3.5. Перепрограммирование соматических клеток в нейральные .. 83
  3.6. Механизмы действия малых молекул при индуцировании эмбриональных и нейральных стволовых клеток из соматических
  клеток ................................................86
4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ КЛЕТОК, НЕСУЩИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ГЕНЫ (генно-клеточная терапия) .......... 89
5. НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ВОЗМОЖНЫЕ
ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ...................... 95
  5.1. Болезнь Паркинсона ......................................95
  5.2. Болезнь Геттингтона.................................... 101
  5.3. Боковой амиотрофический склероз ....................... 104
  5.4. Нейрональный цероидный липофусциноз ................... 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................. 110
ПРИЛОЖЕНИЕ ............................................. 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................... 120

3

            Список сокращений



6-OHDA - 6-гидроксидофамин
A2B5 - белковый маркер нервных клеток
Akt - белки семейства протеинкиназ В
Ang1 - ангиопоэтин 1 (angiopoietin 1)
Ascl1 - Achaete-scute homolog 1
BDNF - мозг производный нейротрофический фактор
BFABP - белок мозга, связывающий жирные кислоты (brain fatti acidbinding protein)
bHLH - структурный мотив белков спираль-поворот спираль (basic-helix-loop-helix)
BME - бета-меркаптоэтанол
BMP - костный морфогенетический белок
BrdU - бромодеоксиуридин
Brn2 - транскрипционный фактор POU домена
c-Myc, - транскрипционный фактор - протоонкогенный белок
CNP - белок, участвующий в метаболизме миелинизирующих клеток
2,3-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase
CNTF - цилиарный нейротрофический фактор
CXC - хемокин
CXCR4 -рецептор CXC типа 4
D609 - трициклодекан-9-ил-ксантогенат
DA - дофамин
DAT - транспортер дофамина
DCX - даблкортин
DG - зубчатая фасция гиппокампальной формации
Dlx - distal-less homeobox фактор транскрипции
ECS - электроконвульсивные воздействия (Electroconvulsive seizure treatment)
EGF - эпидермальный фактор роста
EGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок
EGL external germinal layer
En1 - Homeobox protein engrailed-1
FGF - фактор роста фибробластов
Foxa2 - forkhead box protein A2 (гепатоцитарный транскипционный фактор)

4

Список сокращений

G1 регулятор p27Kip1 - белок семейства CKI необходимого для нормального клеточного цикла
GABA - гамма-аминомасляная кислота
GalC - галактозилцерамидаза
G-CSF - гемапоэтический фактор - колонии стимулирующий фактор гранулоцитов granulocyte colony-stimulating factor
GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок (glial fibrillary acidic protein)
GSK3 - киназа гликогенсинтазы
GFP - зеленый флуоресцентный белок
HEK-293 - линия клеток, полученная из эмбриональной почки человека
Iba-1 - белковый маркер микроглии
IBMX изобутилметилксантин - ингибитор фосфодиэстеразы
ICH - внутримозговое кровоизлияние
IGF-1 - инсулиновый фактор роста 1
IL8 - интерлейкин - 8
iNOS - индуцибельная форма NO-синтазы
iPS - индуцированные стволовые (плюрипотентные) клетки
Klf4 - крюппель-подобный фактор 4 (kruppel-like factor 4)
LacZ - лактозный оперон - репортерный ген, используемый в генных конструкциях
Lewis X (LeX) - 3-fucosyl-N-acetyl-lactosamine = CD15
Lmx1a - LIM homeobox transcription factor 1, alpha
MAPK - митоген-активированная протеинкиназа
MAP2 - белок, связанный с микротрубочками 2 (Microtubule-associated protein 2)
Mash1 - bHLH транскрипционный фактор
MBP - основной белок миелина
MCAo - окклюзия среднемозговой артерии
MEK - киназа MAPK/ERK
MPO - миелопероксидаза
MPTP - пронейротоксин - (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)
MSI1 - РНК связывающийся белок гомолог Musashi-1
Myod - белок, регулирующий дифференцировку мышц
NCAM - адгезивная молекула нервных клеток
Nes - белок промежуточных филаментов - маркер нейральных стволовых клеток

5

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

NeuN - ядерный белок нейронов - маркер нервных клеток.
NeuroDl - транскрипционный фактор нейрональной дифференцировки
(Neurogenic differentiation 1)
NGF - фактор роста нервов
Ngn2 - нейрогенин 2
Notch1 - трансмембранный рецептор
NSE - нейрон специфическая энолаза
NT-3 - нейротрофин 3
Nurr1 - ядерный рецептор, участвующий в поддержании дофаминэргической системы (Nuclear receptor related 1 protein)
O4 - белковый маркер олигодендроцитов
OHT (4-hydroxy-tamoxifen) - синтетический анаболико-андрогенный стероид
Olig2 - олигодендроцитарный bHLH транскрипционный фактор
PCR - метод полимеразной цепной реакции
PDGF - фактор роста тромбоцитов (англ. Platelet-derived growth factor, PDGF)
PSA-NCAM - полисиалированная форма NCAM (polysialilated-neural cell adhesion molecule)
QNP - находящийся в покое нейральный предшественник quiescent neural progenitors
RMS - ростральный миграционный путь
RT PCR - ПЦР в реальном времени
SCZ - субкаллозальная пролиферативная зона мозга
SDF1 - stromal-derived factor 1
SF - ферулат натрия - противотромботическое средство традиционной китайской медицины
SHH - белок sonic hedgehog играющий ключевую роль в органогенезе млекопитающих
SN черная субстанция (substantia nigra)
SNCA - синуклеин альфа
Sox2 - транскрипционный фактор, поддерживающий плюрипотентность
SVZ - субвентрикулярная пролиферативная зона мозга
Tau - белок, ассоциированный с микротрубочками
TGFalpha - транформирующий фактор роста (Transforming Growth
Factor Alpha)
TH - тирозингидроксилаза

6

Список сокращений

Tie2 - трансмембранный рецептор тирозинкиназы, регулирующий ангиогенез
trk-А - рецептор семейства тирозинкиназ аффинный к NGF
TuJ1 - белок класса tubulin Р III, ранний нейрональный маркер
TUNEL - метод выявления апоптозных клеток (Transferase mediated dUTP Nick End Labeling)
VEGF - фактор роста эндотелия
БП - болезнь Паркинсона
БГ - Болезнь Геттингтона
мРНК - матричная РНК
МСК - мезенхимальная стволовая клетка
НСК - нейральная стволовая клетка
ПКС - прогениторные клетки сетчатки
РТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
СКЖТ - стромальная (стволовая) клетка жировой ткани цАМФ - циклическая аденозин монофосфорная кислота ЦНС - центральная нервная система
ЭСК - эмбриональная стволовая клетка (из бластоцисты)
CREB - cAMP response element-binding protein

7

            ВВЕДЕНИЕ



    Более 600 расстройств могут поражать нервную систему. Они включают такие заболевания, как нейродегенеративные расстройства как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз, болезнь Геттингтона (БГ), прионные заболевания, лобно-височная дегенерация, а также рак мозга, энцефалит, эпилепсия, гидроцефалия, инсульт, рассеянный склероз и многие другие. По данным Всемирной организации здравоохранения, до 35% населения Европы страдает от заболеваний мозга. Прямые затраты на здравоохранение при заболеваниях головного мозга, включая визиты к врачам, стационарную помощь и лекарства, составили 24% от общих расходов на здравоохранение Европейского Союза в 2010 году.
    Наиболее частыми расстройствами головного мозга являются нейродегенеративные заболевания. Они представляют собой гетерогенную группу расстройств, которые характеризуются прогрессирующей дегенерацией структуры и функции центральной нервной системы или периферической нервной системы.
    Как правило, нейродегенеративные заболевания характеризуются потерей нейронов и синапсов, специфической для болезни нейродегенерации, которая в конечном итоге приводит к когнитивным и/или моторным нарушениям. Эти расстройства приводят к прогрессирующему повреждению головного мозга, которое постепенно разрушает мыслительные способности, способность вспоминать и, наконец, способность выполнять простые задачи.
    Патоморфологически нейродегенеративные заболевания обычно характеризуются снижением численности нейронов в определённых структурах центральной нервной системы и нередко формированием в оставшихся нейронах или глиальных клетках различных внутриклеточных включений, как правило, вызванных распадом клеточного скелета. При некоторых нейродегенеративных заболеваниях (напр., идиопатических мышечных дистониях или болезни Туретта) явных патоморфологических изменений не выявляется, и клинические признаки объясняются нарушением обмена нейромедиаторов. Для нейродегенеративных заболеваний характерно избирательное вовлечение нейронов, принадлежащих к одной системе мозга или нескольким системам центральной нервной системы (мультисистемные

8

1. Основания заместительной клеточной терапии...

дегенерации). В то же время нейродегенеративные заболевания оставляют сохранными другие нейронные системы, даже если они близко расположены к поражённым. Избирательность поражения нейронов объясняется структурными или биохимическими особенностями, свойственными этим клеткам или окружающим их глиальным элементам.
    Прогнозируется, что в ближайшие несколько лет нейродегенеративные заболевания станут самой серьезной проблемой, стоящей перед человечеством. Были разработаны многие методы лечения нейродегенеративных заболеваний, однако до настоящего времени большинство из них нацелено на симптомы, а не на саму болезнь и ее причины. По-прежнему на рынке нет лекарств, которые могут вылечить нейродегенеративные заболевания.
    Клеточные технологии произвели революцию в области медицины за последние несколько десятилетий. Показано, что стволовые клетки (СК) могут оказаться бесценными для лечения многих заболеваний, поражающих различные органы в организме человека. СК представляют собой недифференцированные клетки, которые обладают значительным потенциалом для дифференцировки в различные клетки организма. Кроме того, в многочисленных тканях резидентные СК, специфичные для этих тканей, служат своего рода внутренним восстановительным резервом. В исследовательских лабораториях были созданы многочисленные варианты СК, способных развиваться и дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки. Трансплантация первичных нервных клеток, полученных из фетального или взрослого мозга, имеет фундаментальные и существенные отличия от трансплантации размноженных в условиях культуры (in vitro) нейральных стволовых клеток (НСК). Были изучены многие методы применения разнообразных СК для лечения неврологических заболеваний в качестве вариантов терапии. Для этих целей были испробованы плюрипотентные СК, мультипотентные взрослые СК, такие как эмбриональная ткань головного мозга, ткань, производная от плодного спинного мозга, НСК или нервные клетки-предшественники (пргениторные клетки), и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из костного мозга и из жировой ткани, СК из пуповинной крови и СК пуповины.

9

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

    В последние годы трансплантация клеток в головной и/или спинной мозг исследовалась как потенциальное средство лечения ряда заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как болезнь Паркинсона, болезнь Геттингтона, рассеянный склероз, черепномозговая травма, травма спинного мозга, инсульт и ряд других состояний. Эксперименты охватывают трансплантации различных типов клеток, включая клетки, полученные и выращенные до пересадки in vitro, а также мобилизацию эндогенных стволовых клеток мозга.
    Однако стратегия заместительной клеточной терапии для неврологических расстройств не является единственным подходом. Клеточная терапия - трансплантация клеток в различные участки мозга или периферической нервной системы - может быть использована для замещения недостающих ферментов при болезнях, обусловленных врожденными ошибками метаболизма. Примерами такого использования могут послужить, доставка нейротрофических факторов (например, GDNF при болезни Паркинсона), обеспечение каркаса для роста аксонов (например, клеток Шванна при повреждении спинного мозга). Трансплантация клеток может служить в качестве наилучшего метода доставки терапевтических агентов. Для этой цели могут быть использованы трансгенные клетки - клетки, в которые внесены генные конструкции содержащие гены белков или пептидных факторов, обладающих терапевтической активностью (например, доставка цитотоксических лекарств с использованием клеток нервных предшественников для лечения опухолей головного мозга).
    В настоящей работе изложены предпосылки, основные результаты исследований и примеры клинических испытаний, посвященных разработке методов терапии различных нейродегенеративных заболеваний с помощью клеточных технологий.

10

            1.  ОСНОВАНИЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ БОЛЕЗНЕЙ


    Открытие нейральных стволовых клеток выявило гораздо более высокую структурную и функциональную пластичность во взрослой нервной системе, чем предполагалось ранее. Показано существование пролиферирующих стволовых клеток во взрослом мозге, которые при определенных условиях могут создавать новые нервные (нейроны) и глиальные (астроциты, олигодендроциты) клетки. Новые нейроны в свою очередь мигрируют, встраиваются в нейронные сети и могут участвовать в процессах посттравматической репарации, замещая погибшие клетки. Эти знания позволяют по новому понять функционирование мозговой ткани в норме и патологии.
    Во взрослом мозге млекопитающих, включая человека, найдены несколько пролиферативных зон. В этих зонах локализуются так называемые региональные нейральные стволовые клетки, которые в определенных обстоятельствах делятся и дают начало новым клеткам. Эти факты дали основание для разработки новых методов терапии, а именно так называемой клеточной терапии. Наличие делящихся и мигрирующих нервных клеток в мозге млекопитающих говорит о возможности замещения погибающих клеток новыми здоровыми эндо-или экзогенными клетками. В этой главе мы опишем результаты исследований мозга лабораторных животных и человека, послуживших основанием для интенсивного развития клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.

        1.1. Понятие о нейральных стволовых клетках

    Открытие стволовых клеток в нервной системе взрослого организма вызвало переоценку целого ряда устоявшихся представлений, в особенности касающихся восстановительных процессов в центральной нервной системе. Стволовая клетка в нервной системе характеризуется теми же основными свойствами, что и стволовая клетка вообще. Известны молекулярные маркеры, позволяющие идентифицировать как стволовые нервные клетки, так и последовательные фазы их дифференцировки [1]. Следует, однако, отметить, что эти маркеры условны и их значимость зависит, в частности, от того, в каком

11