Методы экспресс-анализа пыльцы растений и спор патогенных грибов Беларуси

УДК 581.331/.332.083.32
ББК 28.53

Ш18

Р е ц е н з е н т ы:
доктор геологических наук М. С. Комар,
доктор биологических наук Г. Ф. Рыковский,
кандидат биологических наук О. С. Гапиенко

Работа выполнена при поддержке Белорусского республиканского фонда
фундаментальных исследований (грант № Б12-077).

ISBN 978-985-08-1801-0
© Шалабода В. Л., Дмитриева С. А., 2015
© Оформление. РУП «Издательский дом

«Беларуская навука», 2015

Шалабода, В. Л. 
Методы экспресс-анализа пыльцы растений и спор патогенных грибов 

Беларуси : практ. пособие / В. Л. Шалабода, С. А. Дмитриева ; под ред. 
акад. В. И. Парфёнова ; Нац. акад. наук Беларуси, Ин-т эксперимент. ботаники имени В. Ф. Купревича. – Минск : Беларуская навука, 2015. – 41 с.
ISBN 978-985-08-1801-0.

Описаны методы экспресс-анализа пыльцы растений и спор грибов в помещениях 
с натуральным воздухообменом. Дана оценка способности различных материалов аккумулировать внутри помещений бытовую пыль, содержащую пыльцу растений и споры 
патогенных грибов, возможности использования клейкой ленты для фиксации этой пыли. 
Представлены результаты изучения сохранности пыльцы в закрытом помещении с естественным воздухообменом в течение сезона пыления и после него.
Содержит краткие описания пыльцы аллергенных растений и спор грибов, а также Атлас микрофотографий пыльцы растений и спор патогенных грибов в помещениях  
с натуральным воздухообменом.
Для специалистов в области палинологии, микологии, аллергологии, ботаники, экологии, криминалистики, а также преподавателей и учащихся вузов биологического, географического, экологического профиля и широкого круга читателей.

УДК 581.331/.332.083.32
ББК 28.53 

Ш18

ПРЕДИСЛОВИЕ

Аэробиология – сравнительно молодая отрасль современной биологии. 
Одним из ее направлений является аэропалинология, изучающая состав и закономерности формирования спорово-пыльцевой компоненты атмосферного 
аэрозоля, так называемого пыльцевого дождя. Таксономическое разнообразие 
и концентрация в воздухе пыльцы и спор зависит от структуры растительного покрова, метеорологических факторов, ежегодной сезонной динамики пыления и пыльцевой продуктивности растений. В Беларуси изучение пыльцы  
и спор в аэрозоле для целей аллергологии впервые было проведено в 1990-е годы  
в Витебске Н. С. Гуриной. Начиная с 2006 г., такие исследования проводят систематически при помощи стационарной ловушки Буркарда в Минске.
В настоящее время на базе ГНУ «Институт экспериментальной ботаники 
имени В. Ф. Купревича Национальной академии наук Беларуси» функционирует первая и пока единственная в Беларуси стационарная аэропалинологическая станция (BYMINS Minsk), включенная в сеть европейского мониторинга. 
Наличие станции позволяет проводить ряд исследований по распространению 
аллергенной пыльцы в городе. Данные аэропалинологического мониторинга 
сопоставляются с изучением динамики пыления наземных растений. Многолетний опыт позволяет сравнивать наши данные с составом бытовой пыли помещений. Определенный фактический материал, полученный нами в результате 
отбора образцов в 2005–2006 гг. в Минске, в 2008–2009 гг. в Минске, Минской  
и Брестской областях, в 2011 г. в Витебске позволил разработать и опубликовать 
ряд оригинальных методик по изучению бытовой пыли в помещениях, а также 
метод экспресс-анализа пыльцы и спор.
В книге приведено описание методических приемов подготовки образцов  
к анализу и представлен рабочий атлас пыльцы и спор, встречающихся в различных помещениях на территории Беларуси.
Академик В. И. Парфёнов

ВВЕДЕНИЕ

Аэропалинология – область современной аэробиологии, изучающая состав  

и закономерности формирования «пыльцевого дождя», состоящего из пыльцевых зерен (п. з.), спор и некоторых других палиноморф. Целью аэропалинологии является изучение состава, концентрации и морфологии биологических  
и индустриальных частиц атмосферного аэрозоля для оценки загрязнения  
воздуха.
Аэропалинологические исследования направлены на изучение уровней 
аллергенной пыльцы растений и спор грибов в атмосферном воздухе, так как 
заболевания, вызванные аэроаллергенами, снижают качество жизни и наносят 
экономический ущерб, приобретая массовый характер. Накопленный материал позволяет говорить о важности этих исследований для Беларуси. В каждом 
географическом регионе отмечаются свои особенности пыления растений, связанные с климатическими условиями, особенностями растительного покрова, 
экологическими условиями и т. п. Выявление этих особенностей и закономерностей появления пыльцы и спор определенных таксонов в составе атмосферных аэрозолей позволит в дальнейшем прогнозировать развитие аллергоопасной обстановки и возникновение вспышек поллинозов в каждом конкретном 
регионе.
В то же время эти исследования помогают решить ряд других вопросов, 
связанных с пыльцой и спорами в атмосферном аэрозоле и в составе бытовой 
пыли. Попадая вместе с потоком воздуха в помещения, пыльца и споры накапливаются и сохраняются вместе с другой бытовой пылью на различных предметах вблизи открытых окон и дверей квартир, а также на балконах, в гаражах 
и в других подсобных помещениях с естественным воздухообменом. Люди, 
проводя большую часть времени в закрытом помещении, должны знать и понимать, как важны факторы, влияющие на присутствие аэроаллергенов в помещении, и какую потенциальную опасность представляют эти аэроаллергены. Как 
долго они могут сохраняться в составе пыли, могут ли вызывать аллергию при 
длительном хранении? Эти и некоторые другие вопросы нам предстояло выяснить в процессе выполнения данной работы.
Загрязнение воздуха внутри помещений – одна из главных экологических 
проблем во многих странах. Поэтому очень важно иметь данные для влияния 

на уровни загрязнения. Основными частицами, содержащимися в атмосферном 
аэрозоле и влияющими на здоровье человека, являются пыльца, споры и индустриальные частицы PM (particulate matter). В основном изучение биологических и индустриальных частиц проводится разными методами и в разных 
лабораториях, что затрудняет сопоставление результатов. Комплексное изучение этих частиц проводится единично (по всему миру, но лишь в отдельных 
лабораториях) и пока не приобрело массовый характер.
Современные люди проводят много времени в закрытых помещениях. Внутренние воздушные загрязнители могут вызывать астматические и аллергические реакции. Уровни загрязнения воздуха внутри помещений, составляя только ⅓ от наружного загрязнения, влияют на здоровье работающих так же, как  
и наружное. Так, аллергенным для помещений является содержание спор грибов 1000 частиц в 1 м3 воздуха (⅓ от наружного уровня), а пыльцы – 15 частиц  
в 1 м3 воздуха (⅓ от наружного уровня). Плохому качеству воздуха внутри помещений во многом способствуют современные дома, где предусмотрено низкое 
энергопотребление. Эти дома построены таким образом, что удерживают воздух 
внутри помещений и не подвержены резким колебаниям температуры. Однако 
то, что способствует экономии энергии, не обязательно обеспечивает хорошее 
качество воздуха внутри помещений. Такой тип строительства не позволяет 
дому «дышать». Открытые окна не всегда помогают, особенно если в доме  
кто-то страдает от аллергии. Чаще всего в таких домах используют различные 
воздухоочистители, которые, в свою очередь, при редкой замене фильтров становятся источниками загрязнения.
Систематические сезонные аэропалинологические исследования атмосферного аэрозоля в Беларуси проводят с 2001 г. Постоянная аэропалинологическая 
станция (первая и единственная в Беларуси) работает в Минске с 2006 г. по 
стандартным, общепринятым в европейских государствах методикам, что позволяет включать станцию BYMINS Minsk и ее данные в европейские базы данных EPI (EAN) и Polleninfo. В настоящее время работа станции осуществляется 
на базе ГНУ «Институт экспериментальной ботаники имени В. Ф. Купревича 
Национальной академии наук Беларуси».
Данные аэробиологии используют в таких отраслях науки и хозяйственной 

деятельности, как: аллергология, сельское хозяйство, лесное хозяйство / лесоводство, садоводство, экология, ботаника, таксономия, систематика, биоповреждения, мелиссопалинология, палинология, криминалистика, генетика, 
климатология, метеорология, наука об аэрозолях, гигиена окружающей среды, 
биотерроризм.
Целью данного исследования является разработка методов экспресс-анализа 
пыльцы растений и спор грибов, находящихся в составе бытовой пыли внутри 
помещений с естественным воздухообменом.
В настоящее время для изучения пыльцы растений в составе бытовой пыли 
внутри помещений применяют различные методики [14, 18], требующие длительной и сложной обработки материала. Споры грибов при этом разрушаются, 

а сферические техногенные частицы (сферулы) не учитываются. Для определения спор грибов в составе пыли в помещениях требуется выращивание колоний грибов на различных средах и при различных температурах, что, в свою 
очередь, требует времени и наличия специально оборудованных лабораторий. 
Все названные методы очень важны при тщательном исследовании, но иногда 
для быстрой предварительной оценки загрязнения требуется экспресс-анализ, 
который не может служить заменой основным методам изучения пыльцы растений и спор грибов в составе бытовой пыли, но может ускорять и дополнять 
уже известные методы.
Преимущество предлагаемой и используемой нами методики заключается 
в том, что: материал быстро готовится к просмотру (фиксация и окрашивание 
занимают мало времени); пыльца растений, споры грибов и техногенные частицы находятся в одном образце; в образце присутствуют споры аллергенных  
и патогенных грибов, которые не прорастают на питательных средах.
Сравнение и определение пыльцы и спор проводили при помощи светового микроскопа (СМ) по эталонным препаратам, приготовленным по аналогичной методике, и по имеющимся атласам пыльцы и спор. Просмотр отдельных 
образцов в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) использовали как 
вспомогательный метод: для уточнения определений.
Объекты исследования. Бытовую пыль собирали с различных поверхностей и материалов. Для исследования выбирали поверхности и объекты вблизи 
открытых окон, на балконах и т. п., где длительное время накапливалась пыль. 
При помощи стационарной ловушки получали контрольные образцы.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

п. з. – пыльцевое(ые) зерно(а)
PM2,5 (particulate matter) – твердые частицы аэрозоля (цифра – диаметр частиц в μm)
СМ – световой микроскоп
СЭМ – сканирующий электронный микроскоп
х/б ткань – хлопчатобумажная ткань
μm – микрон

ПРИБОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ  
АЭРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящее время не существует универсальных ловушек, пригодных для 
исследования всех типов биологических частиц. Каждая область исследований 
(палинология, микология, вирусология и т. п.) требует своих методов отбора 
образцов, последующей обработки и идентификации материала [15]. В основном используют два принципа улавливания биологических частиц: с помощью 
гравитации – гравитационные (взвешенные в воздухе частицы осаждаются 
под действием силы тяжести на горизонтальную поверхность) и импакторные 
(impaction – столкновение) – взвешенные в воздухе частицы движутся вместе  
с потоком воздуха и осаждаются на поверхности различных типов и ориентации. Они, в свою очередь, бывают естественными (ветер) или искусственно 
созданными (волюметрические) с применением различных насосов. Большинство импакторных ловушек относится к волюметрическому типу, поток воздуха  
в них создается принудительно, за счет работы воздушной помпы. Американские и канадские исследователи в основном пользуются ловушками, произведенными в исследовательских центрах США; в Европе используют ловушки 
фирм Burkard (Англия) и Lanzoni (Италия), при явном преобладании пыльцеуловителей фирмы Burkard.
Для контроля за биологической составляющей атмосферного аэрозоля была 
использована семидневная ловушка Буркарда (рис. 1), СЭМ «JEOL JSM-35C» 
(рис. 2) и световые биологические микроскопы.
Принцип работы ловушки следующий. На барабан наклеивают ленту 
MELINEX, поверх которой наносят улавливающую смесь. Барабан помещают  
в камеру с узкой щелью. Через камеру прокачивают воздух со скоростью дыхания человека (10 л/мин), твердые частицы аэрозоля попадают через щель  
в камеру и фиксируются на липкой ленте барабана. Барабан, соединенный с ча- 
совым механизмом, вращается со скоростью 2 мм/ч (за сутки 48 мм). Завод  
часового механизма и окружность барабана рассчитаны на 7 дней, по прошествии которых барабан заменяют, ленту снимают, разрезают ее на участки, соответствующие одним суткам, окрашивают фуксином или сафранином  
и просматривают в СМ поперечными или продольными транссектами. Расчет 
содержания количества таксонов производят в кубическом метре воздуха за 
сутки [15]. Данные заносят в рабочий журнал, а затем в таблицы.

Применение СЭМ для изучения состава аэрозолей показало высокую эффективность таких исследований по нескольким параметрам, так как оно позволяет:
– изучать субмикронные биологические и индустриальные частицы, которые из-за малых размеров не могут быть идентифицированы в обычном микроскопе, но которые представляют опасность для здоровья населения. Эти частицы вместе с потоком воздуха легко обходят защитные механизмы дыхательных 
путей человека, попадая непосредственно в легкие, а также могут служить дополнительным источником заражения и причиной усиления аллергии;
– отмечать изменения и разрушения у пыльцы, незаметные в СМ, но способные влиять на ее аллергенные свойства.
Для изучения состава аэрозоля в СЭМ на крышу ловушки помещают предметный столик электронного микроскопа с наклеенной двухсторонней клейкой 
лентой Scotch-3M (рис. 3). Столик заменяют каждые сутки, напыляют проводящим составом и просматривают в СЭМ. Дополнительное улавливание частиц 
необходимо использовать как для более надежной идентификации спор грибов, 
так и для изучения субмикронных частиц, сопутствующих пылению [32–34].

Рис. 1. Пыльцевая ловушка Буркарда
Рис. 2. СЭМ «JEOL JSM-35C»

Рис. 3. Прозрачная клейкая лента: а – односторонняя; б – двухсторонняя
а
б

МЕТОДЫ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА

Отбор образцов из воздуха обычно осуществляют при помощи гравиметрических и импакторных волюметрических ловушек по стандартным методикам. 
Нами разработана и использована оригинальная методика улавливания микрочастиц из атмосферы на поверхность клейкой ленты, применение которой 
широко практикуется в судебно-медицинской экспертизе. В качестве подставки нами были использованы столики СЭМ (рис. 4). На поверхность столиков 
наклеивали стекла с клейкой лентой площадью 1 см2. Ловушки устанавливали 
навстречу ветровому потоку под углом 45о. Такая ловушка позволяет фиксировать большинство объектов из воздуха в диапазоне от 1 до 100 μm и комплексно 
оценивать объекты воздушного загрязнения. Экспозиция продолжается 24 ч.  
Поверхность ловушки изучают в СЭМ (в данном случае «JEOL JSM-35C»), 
аналитик определяет и подсчитывает объекты [16]. После изучения в СЭМ 
клейкую ленту снимают с подставки, окрашивают фуксином и просматривают 
в СМ. Данная методика, разработанная в ГНУ «Институт экспериментальной 
ботаники имени В. Ф. Купревича Национальной академии наук Беларуси», позволяет расширить круг изучаемых объектов и более точно их определять.
Отбор образцов из пыли помещений выполняли при помощи ткани с последующей фиксацией на клейкой ленте и окрашиванием фуксином или на клей
Рис. 4. Образцы пыли на клейкой ленте, закрепленные на предметных столиках СЭМ

кую ленту с последующим окрашиванием (рис. 5), а просмотр и подсчет объектов в образцах – при помощи СМ и СЭМ. Для определения таксонов применяли 
определители пыльцы и спор [3, 5–10, 12, 25, 26, 28, 30, 31, 35, 38]. Использовали также базы данных «PollenInfo», «PalDat», «APMRU» «RNSAGB2» и образцы из личной коллекции, а для обработки рисунков – программу «Photoshop»  
и графический редактор «Point».
Подготовка образцов для СЭМ. Если подложка позволяла, то из нее вырезали небольшие куски (1 см2) и наклеивали на предметный столик для СЭМ 
(образец пригоден только для СЭМ).
Комплексная подготовка образцов для СЭМ и СМ.
Метод А: отбор пыли производили на прозрачную двухстороннюю клейкую ленту или на прозрачную одностороннюю клейкую ленту (использование 
прозрачной клейкой ленты не является оригинальным, этот метод широко практикуется во многих исследованиях). Для извлечения материала использовали 
следующие методы.
Метод А1: на предметное стекло наклеивали прозрачную двухстороннюю 
клейкую ленту; стекло вместе с лентой переворачивали и прижимали к объекту; операцию повторяли многократно и последовательно; по мере заполнения 
ленты, которое определяли на глаз, останавливали процесс отбора материала на 
этом стекле и продолжали на другом.
Метод А2: одностороннюю прозрачную клейкую ленту закрепляли на катушке клейкой стороной наружу; катушку с клейкой лентой последовательно 
прокатывали по поверхности изучаемого объекта; ленту заменяли по мере заполнения.
Далее клейкую ленту обрабатывали в зависимости от того, на каком микроскопе было решено осуществлять просмотр (рис. 6).
Метод Б: отбор пыли производили на х/б ткань, которую можно просматривать в СЭМ (рис. 7) или снимать с нее материал на клейкую ленту для просмотра  
в СМ (см. рис. 3).

Рис. 5. Образец пыли для СМ на липкой ленте, зафиксированный в глицериножелатиновой смеси 

и окрашенный фуксином