Андрей Билан
Микромицеты зерна овса, их токсигенность и влияние FUM В1 на цыплят

Андрей Билан








Микромицеты зерна овса, их токсигенность и влияние FUM В1 на цыплят






















LAP LAMBERT Academic Publishing

Impressum / Выходные данные
Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek: Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet uber http://dnb.d-nb.de abrufbar.
Alle in diesem Buch genannten Marken und Produktnamen unterliegen warenzeichen-, marken- oder patentrechtlichem Schutz bzw. sind Warenzeichen oder eingetragene Warenzeichen der jeweiligen Inhaber. Die Wiedergabe von Marken, Produktnamen, Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen u.s.w. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von jedermann benutzt werden durften.

Библиографическая       информация,       изданная Немецкой
Национальной Библиотекой. Немецкая Национальная Библиотека включает данную публикацию в Немецкий Книжный Каталог; с подробными библиографическими данными можно ознакомиться в Интернете по адресу http://dnb.d-nb.de.
Любые названия марок и брендов, упомянутые в этой книге, принадлежат торговой марке, бренду или запатентованы и являются                брендами                соответствующих
правообладателей. Использование названий брендов, названий товаров, торговых марок, описаний товаров, общих имён, и т.д. даже без точного упоминания в этой работе не является основанием того, что данные названия можно считать незарегистрированными под каким-либо брендом и не защищены законом о брендах и их можно использовать всем без ограничений.

Coverbild / Изображение на обложке                предоставлено:
www.ingimage.com

Verlag / Издатель:
LAP LAMBERT Academic Publishing
ist ein Imprint der/ является торговой маркой
OmniScriptum GmbH & Co. KG
Heinrich-Bocking-Str. 6-8, 66121 Saarbrucken, Deutschland / Германия Email / электронная почта: info@lap-publishing.com

Herstellung: siehe letzte Seite/
Haпечатано: см. последнюю страницу
ISBN: 978-3-659-67555-3

Zugl./Утверд.: Белая Церковь, Белоцерковский национальный аграрный университет

Copyright/АВТОРСКОЕ ПРАВО © 201 5 OmniScriptum GmbH & Co. KG
Alle Rechte vorbehalten./ Все права защищены. Saarbrucken 201 5

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ                             2
ВВЕДЕНИЕ                                                 3
ГЛАВА 1. Обзор литературы                               12
1.1. Распространение микромицетов                       12
1.2. Биологическое действие микотоксинов                20
1.3. Микотоксины грибов рода Fusarium                   23
1.4. Влияние микотоксинов Fusarium moniliforme Sheldon на организм животных                                       25
1.5. Методы определения токсигенности микромицетов      30
1.6. Методы нейтрализации микотоксинов                  37
ГЛАВА 2. Выбор направления исследований                 40
2.1. Материалы и методы исследований                    40
2.2. Методы микологических исследований                 40
2.3. Методы микотоксикологических исследований          43
2.4. Методы биохимических и патоморфологических исследований 48
ГЛАВА 3. Определение количественного и качественного состава микобиоты зерна                                         51
ГЛАВА 4. Изучение токсигенных свойств выделенных грибов 58
4.1. Определение способности фузариев продуцировать токсины 58
4.2. Токсигенные свойства грибов Aspergillus flavus и Alternaria alternata                                                73

4.3. Влияние факторов внешней среды на биосинтез монилиформина и фумонизина В! грибом F. moniliforme Sheldon             75
4.4. Изучение характера действия культуральной жидкости гриба Fusarium moniliforme Sheldon на белых мишей               80
4.5. Изучение влияния фумонизина В1 на организм цыплят и протективного действия «Микосорба»                        83
ГЛАВА 5. Разработка методики экспрессного определения способности грибов рода Fusarium продуцировать зеараленон (F-2

токсин)                                              93
ГЛАВА 6. Анализ и обобщение результатов исследований 99
ВЫВОДЫ                                              110
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ                           112
Список литературы                                   113

        ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ТСХ - тонкослойная хроматография
МДС - максимально допустимый уровень
ТТМТ - трихотеценовые микотоксины
АТА - алиментарная токсическая алейкия
ДОН - дезоксиниваленол
УФ - ультрафиолет
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ЛЭП - лейкоенцефаломаляция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
КОЕ - колониеобразующие единицы
СДС - сахарно-дрожжевая среда
Rf - хроматографическая подвижность
ИФА - иммуноферментный анализ
АЛТ - аланинаминотрансфераза
АСТ - аспартатаминотрансфераза
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
ФУМ - фумонизин
MON - монилиформин
ЩФ - щелочная фосфатаза
КФ - кислая фосфатаза

2

        ВВЕДЕНИЕ

     Проблема обеспечения населения качественными продуктами питания основная задача агропромышленного комплекса. Этот вопрос решается внедрением новейших технологий в растениеводстве, обеспечивающих высокие урожаи зерновых, а в животноводстве - повышением продуктивности животных. При этом большое значение имеет обеспечение животноводства качественными зернофуражными кормами, а также внимание уделяется зерну, что закладывается на длительное хранение для дальнейшего использования. Условия хранения определяются комплексом взаимодействий в зерне, макро- и микро средой, а также разнообразными организмами, включающие микроорганизмы, насекомых, грызунов и птиц.
     Актуальность этого вопроса обусловлена биологическими свойствами зерна, представляет собой богатый источник различных высококалорийных питательных органических соединений, макро- и микроэлементов. Даже после уборки урожая зерно все еще остается живым организмом, в котором происходят процессы метаболизма и дыхания.
     Среди контаминантов зерна особое место занимают микроскопические грибы и синтезированные ими микотоксины. Поражение зерна микроскопическими грибами может происходить во время цветения, роста, созревания и хранения. Это обусловлено широким распространением грибов в природе, которые при благоприятных условиях поражают корма, в том числе и зерновые, продукты питания и производят различные микотоксины. Степень колонизации зерна микромицетами при хранении зависит от условий окружающей среды температуры, влажности и концентрации кислорода и углекислого газа [1].
     Повышение производства зерна высокого качества и создания надлежащих условий хранения и переработки с целью предупреждения микотоксикозов является одной из основных задач современного сельского хозяйства Украины, как решающего условия улучшения обеспечения населения продуктами питания и дальнейшего экономического развития страны.

3

     Актуальность темы. Овес является одним из самых ценных зерновых культур для кормления сельскохозяйственных животных, а продукты его промышленной переработки используются в питании людей, косметологической и фармацевтической отраслях. Это культура умеренного климата, не прихотлива к теплу, более распространена в зонах Полесья и Лесостепи.
     Зерно овса - ценный диетический корм, который чаще используют в кормлении молодняка и взрослых племенных животных, особенно лошадей. Это обусловлено высокой растворимостью его протеина, содержанием водо- и солерастворимых фракций, которые составляют 55-60%, качественному аминокислотному составу (в 1 кг зерна содержится 5,3 г лизина, 1,7 г метионина, 0,7 г триптофана, 2, 3 г цистина и легкорастворимые углеводы). Клетчатки в зерне овса вдвое больше, чем в зерне других культур (97 г/кг) [2]. Благодаря этому зерно овса входит в состав комбикормов и широко используется в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы. Однако, ценные качества зерна овса могут ухудшаться при поражении его микроскопическими грибами, за счет снижения содержания крахмала и белка.
     Поскольку различные виды микроскопических грибов, способных синтезировать микотоксины находятся в почве и могут поражать зерновые культуры, в том числе и зерно овса, существует опасность накопления микотоксинов. Скармливания такого зерна сельскохозяйственным животным вызывает микотоксикозы, характеризующиеся снижением или потерей производительности и гибелью животных [3, 4].
     В Украине среди микотоксикозов периодически диагностируются фузариотоксикозы сельскохозяйственных животных, вызванные потреблением кормов, пораженных Т-2 и F-2 токсинами. Зарегистрированы случаи заболевания свиней и крупного рогатого скота в Киевской, Кировоградской, Винницкой, Николаевской, Черкасской и Одесской областях. Из подозреваемых в заболевании кормов были изолированы продуценты

4

зеараленона F. graminearum, F. moniliforme, F. culmorum, F. sporotrichiella, F. lateritium и F. sambucinum [5, 6].
      В 40-х годах прошлого века в России фузариотоксины стали причиной эпидемии алиментарной токсической алейкии (АТА). Симптомы включали прогрессирующую лейкопению, септическую ангину, некротические повреждения ротовой полости и пищевода. Задержки при уборке урожая, нарушение требований хранения зерна стали причиной кормления лошадей заплесневелым зерном, которые очень чувствительны к микотоксинам, и вызвали гибель животных [7]. Нами также исследовано и проанализировано случай заболевания лошадей на фузариотоксикоз в частном хозяйстве Донецкой области, а также мы сравнили клинические признаки и биохимические показатели больных животных.
      Установление фузарие-Р-2-токсикоза предусматривает проведение микотоксикологических исследования проб кормов, повлекших заболевание, в которых определяют содержание F-2 токсина и проводят их микологические исследования, высевая на агар Чапека с целью выделения чистых культур грибов-продуцентов. Содержание F-2 токсина в экстракте культуры устанавливают методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) [8, 9], что имеет определенные недостатки - длительность культивирования и присутствие в экстракте коекстрактивних веществ (липидов и пигментов), которые мешают проявлять токсин методом ТСХ. Поэтому актуальной является необходимость разработки експресного способа определения способности грибов рода Fusarium продуцировать зеараленон.
      Микологические исследования зерновых кормов и комбикормов на территории Украины проводились различными учеными [3, 4, 10, 11, 12, 13, 14], но отдельное установление микобиоты зерна овса не проводилось. Исследования были недостаточны и не могли в полной мере осветить микромицеты, которые контаминуруют зерно этой культуры. Также исследователи не устанавливали зонального распространения грибов на зерне овса, выращенного на территории Украины, и устойчивости культивируемых

5

сортов овса к поражению микроскопическими грибами. Не проводились исследования токсигенных свойств грибов, выделенных из зерна овса, и изучение видов микотоксинов, что они производят. Изучение этих вопросов является актуальным и позволит улучшить профилактику и диагностику микотоксикозов сельскохозяйственных животных.
     В 1991 году А. Н. Леоновым и другими исследователями [15] установлена способность всех 37 штаммов Fusarium moniliforme var. lactis, которые были изолированы из кукурузы и пшеницы в южных областях Украины, производить монилиформин и 1/4 часть штаммов производила этот токсин в количестве > 130 мг/кг. Поскольку гриб F. moniliforme является потенциальным продуцентом фузарина С, зеараленона, фузариевой кислоты, монилиформина и фумонизина, исследования фузариев на способность продуцировать эти токсины актуальны.
     Микотоксины - низкомолекулярные соединения, которые обладают способностью к кумуляции в организме и не вызывают иммунного ответа, а достигая порогового уровня вызывают проявление клинических признаков болезни. Накопление микотоксинов в различных органах зависит от их специфики и вида животных, например: монилиформин при проникновении в организм животных и птицы вызывает поражение клеток миокарда, а фумонизин В₁ влияет на обмен сфинголипидов и с его действием связывают развитие лейкоенцефаломаляции лошадиных, отека легких у свиней, первоначального рака пищевода и анэнцефалию у человека [9]. Несмотря на опасность этих фузариотоксинив, остаются не изученными отдельные вопросы их биосинтеза, биологического действия и отдельные аспекты профилактики и лечения.
     Всё выше перечисленное подтверждает остроту проблемы микотоксинов и микотоксикозов для сельского хозяйства.
     Выбранная тема диссертационной работы направлена на изучение микобиоты зерна овса, выращенного на территории Украины, исследования способности изолированных микромицетов производить различные виды микотоксинов,    определение оптимальных условий биосинтеза

6

фузариотоксинив монилиформина и фумонизина В₁ и влияния последнего на организм цыплят, которые являются актуальными в практическом и научном плане.
     Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертация является частью научно-исследовательской работы кафедры микробиологии и вирусологии Белоцерковского национального аграрного университета "Изучение роли микроскопических грибов и микотоксинов в патологии сельскохозяйственных животных" (№ госрегистрации 0103U004470).
     Цель работы - изучить распространение микромицетов на зерне овса в различных регионах Украины, и их токсигенные свойства. Исследовать влияние фумонизина В1 на организм цыплят и протективное действие «Микосорба».
     Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- Изучить количественный и качественный состав микобиоты зерна овса урожая 2004 - 2005 лет из разных регионов Украины;
- Исследовать токсические свойства грибов родов Fusarium и Aspergillus и виды микотоксинов, что они производят;
- Изучить влияние факторов окружающей среды на биосинтез монилиформина и фумонизина В1 грибом Fusarium moniliforme;
- Провести исследования по изучению действия культуральной жидкости гриба F. moniliforme на организм белых мышей, а также влияние фумонизина В1 на цыплят и протективное действие «Микосорба»;
- Разработать экспресс-метод определения способности грибов рода Fusarium продуцировать F-2 токсин.
     Объект исследования - микобиота зерна овса и биосинтез микотоксинов.
     Предмет исследования - микромицет зерна виса, их токсигенные свойства и влияние фумонизина В₁ на цыплят. Микотоксины, биохимические, патолого-анатомические и гистологические показатели, как критерии оценки

7