Синтез и анализ адеметионина

МОНОГРАФИЯ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1 Обзор литературы ......................................... 4
1.1 Современные гепатопротекторные средства с точки зрения доказательной медицины.......................................... 4
1.2  Фармакологические свойства адеметионин-иона, его применение в медицине, лекарственные формы................................. 6
1.3 Физико-химические свойства адеметионин-иона.................. 11
1.3.1 Физические свойства адеметионин-иона....................... 11
1.3.2 Химические свойства адеметионин-иона....................... 11
1.4  Методы качественного и количественного анализа адеметионин-иона и его препаратов................................................... 12
1.5 Способы получения адеметионин-иона........................... 15
1.6  Стабильность адеметионин-иона. Способы повышения стабильности адеметионин-иона................................................. 19
1.6.1 Способы получения стабильных солей адеметионина с сульфокислотами................................................ 20
1.6.2 Способы получения стабильных солей адеметионина с производными таурина........................................... 22
1.6.3 Другие способы повышения стабильности адеметионин-иона....   24

ГЛАВА 2 Разработка методик осаждения адеметионин-иона из растворов..................................................... 25
2.1 Исследование условий осаждения адеметионин-иона с помощью производных таурина ............................................. 25
2.1.1 Разработка способа получения стеарилтаурина ............... 25
2.1.2 Выбор условий осаждения адеметионин-иона .................. 26
2.2  Исследование условий осаждения адеметионин-иона с помощью сульфокислот .................................................... 29

2.3 Разработка методик анализа солей адеметионина-иона .......... 35
2.3.1 Разработка методик анализа соли адеметионина со стеарилтаурином............................................... 35
2.3.2 Разработка методик анализа соли адеметионина с лаурилсульфокислотой........................................... 37
2.3.3 Разработка методик анализа соли адеметионина с хондроитинсульфокислотой......................................... 39

ГЛАВА 3 Исследование условий получения субстанции адеметионин-иона 43
3.1 Выделение дрожжевой массы.................................... 43
3.2  Разработка методики лизиса дрожжевых клеток ................ 44
3.3 Разработка методики выделения адеметионин-иона из лизата .... 45

ГЛАВА 4 Разработка способа получения стабильной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой ................................. 47
4.1 Получение субстанции адеметионин-иона........................ 47
4.2  Разработка методик анализа двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой......................................... 48
4.2.1 Разработка методик качественного анализа двойной соли...... 48
4.2.2 Разработка методик количественного анализа двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой .................. 50

ГЛАВА 5 Изучение стабильности и установление сроков годности солей адемеметионина............................................. 52
Заключение                                                        55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................ 57

Глава 1 Обзор литературы
     1.1       Современные гепатопротекторные средства с точки зрения доказательной медицины
     За последние годы наметилась тенденция к росту числа заболеваний печени. По данным ВОЗ в современном мире заболеваемость различной гепатобилиарной патологией превышает 2 млрд. человек. В странах СНГ ежегодно регистрируется от 500 тысяч до 1 млн. человек, страдающих заболеваниями печени [17].
     Нарушение функции печени возникает при различных патологических состояниях и сопровождается метаболическими расстройствами с развитием токсикозов. Одним из тяжелых осложнений заболеваний печени является печеночная недостаточность [9]. Фармакологическая коррекция заболеваний печени является одной из актуальных задач современной медицины и фармации.
     На сегодняшний день известны два основных направления комплексной терапии заболеваний печени - это этиотропная и патогенетическая [20]. Этиотропная терапия применяется при вирусных гепатитах.
     При патогенетической терапии заболеваний печени применяют лекарственные средства, повышающие устойчивость гепатоцитов к неблагоприятным воздействиям, усиливающие антитоксическую функцию гепатоцитов и способствующие восстановлению функции клеток печени. Эти препараты, относящиеся к различным фармакологическим группам, обозначают термином гепатопротекторы [16].
     В настоящее время, как было указанно выше, патология печени наблюдается у многих людей, поэтому во всех странах ведутся активные поиски гепатопротекторных лекарственных средств. Такие средства различаются по химической структуре, механизму действия и фармакологической активности [20].
     Среди гепатопротекторов можно выделить препараты флавоноидов (карсил, ЛИВ-52, хофитол и др.), аминокислот (адеметионин, орнитин), желчных

кислот (урсодезоксихолевая кислота), витаминов, а также препараты животного происхождения (сирепар, гепатосан) [24,57].
     Необходимо отметить, что в настоящее время адеметионин считается одним из наиболее эффективных гепатопротекторов. Это связано с тем, что он, наряду с высокой активностью, в наибольшей степени соответствует требованиям, предъявляемым к гепатопротекторам, а именно: проявляет низкую токсичность, высокий эффект при первом прохождении, уменьшает воспалительный процесс, стимулирует регенерацию печени, улучшает естественный метаболизм в печени. Эти свойства адеметионина имеют доказательную клиническую базу [7,16,23, 100].
     Почти за четыре десятилетия терапевтического применения адеметионина накопилось достаточно большое количество результатов его клинических исследований при патологии печени, выполненных в соответствии с принципами доказательной медицины и надлежащей клинической практики [67,68,69].
     Получены убедительные доказательства эффективности и безопасности адеметионина при внутрипеченочном холестазе, который представляется «конечным общим путем» многих хронических заболеваний и патологических состояний печени (в период беременности, при остром и хроническом гепатите различной этиологии, циррозе печени) [5,18,26].
     При этом, большая эффективность по сравнению с плацебо продемонстрирована в отношении симптомов (кожный зуд, утомляемость и др.) и биохимических параметров (билирубин, трансаминазы и т.д.) [64,65,66].
     Наряду с этим, в исследовании Дж. Мато получены данные, согласно которым продолжительное лечение адеметионином пациентов с алкогольным циррозом печени может способствовать повышению выживаемости, особенно на более ранних стадиях болезни [72,73].
     В современном клиническом руководстве Европейской ассоциации по изучению печени, посвященном лечению холестатических заболеваний печени, предусмотрено применение адеметионина при внутрипеченочном холестазе

беременных в сочетании с урсодезоксихолевой кислотой, в случае недостаточной эффективности последней при применении в качестве монотерапии [14,19,70].
     Клинические испытания адеметионина при заболеваниях печени активно продолжаются, о чем свидетельствуют опубликованные в последние годы положительные результаты включения адеметионина в современные схемы лечения пациентов с вирусным гепатитом С [23,98,100].

        1.2       Фармакологические свойства адеметионин-иона, его применение в медицине, лекарственные формы

     Адеметионин-ион (8-аденозил-Т-метионин,8ЛМ) является природным веществом, которое синтезируется в печени [56,58,60]. Он широко распространен во всех биологических системах организма и участвует в различных метаболических процессах [2,36, 111].
     В основе гепатопротекторного действия адеметионин-иона лежит его незаменимое участие в жизненно важных биохимических реакциях трансметилирования, транссульфирования и аминопропилирования [61,62]. В печени происходит 85% всех реакций трансметилирования в организме [107].
     Реакции трансметилирования являются важным этапом синтеза фосфолипидов (в первую очередь фосфатидилхолина), обеспечивающих текучесть мембран и их поляризацию, которая играет значительную роль в синтезе компонентов желчи [59,77,90].
     Так, при внутрипеченочном холестазе снижение вязкости мембран, вследствие избыточного отложения в печени холестерина, ведет к нарушению функционирования мембраноассоциированных белковых транспортных систем. Адеметионин, являясь донором метильной группы, принимает непосредственное участие в синтезе фосфатидилхолина [50,51,52].
     Для понимания механизма его защитного действия следует учитывать, что все клеточные мембраны имеют типичное строение и в среднем на 2/3 (мембрана митохондрий - на 92%) состоят из фосфолипидов, 80 - 90% которых представлены фосфатидилхолином [101].

Помимо структурной функции, фосфолипиды участвуют в процессах молекулярного транспорта, делении и дифференцировке клетки, стимулируют активность различных ферментных систем. Нарушение транссульфирования приводит к дефициту глутатиона - важнейшего клеточного антиоксиданта [26].
     Недостаток глутатиона, характерный для хронических заболеваний печени, снижает устойчивость гепатоцитов к повреждающему действию свободных радикалов, постоянно образующихся вследствие метаболизма экзогенных и эндогенных веществ [63, 103].
     Кроме того, адеметионин служит предшественником других тиоловых соединений, таких как цистеин, таурин, коэнзим А [112].
     Наряду с глутатионом таурин играет важную роль в детоксицирующей функции печени [65,95].
     Поскольку конъюгирование таурина с желчными кислотами способствует повышению растворимости последних, снижение содержания таурина ведет к накоплению токсичных желчных кислот в клетках печени. Повышенная концентрация гидрофобных желчных кислот запускает цепь биохимических процессов, конечным итогом которых является гибель гепатоцитов и холангиоцитов посредством апоптоза [38].
     Детоксикация желчных кислот происходит также путем их непосредственного сульфурирования. Сульфурированные кислоты обладают способностью защищать мембраны клеток от повреждающего действия гидрофобных желчных кислот, которые в высоких концентрациях накапливаются при внутрипеченочном холестазе [94].
     Третья группа реакций, в которых принимает участие адеметионин это синтез полиаминов (аминопропилирование) - имеет непосредственное отношение к процессам пролиферации гепатоцитов и регенерации печени [25, 71].
     В этих реакциях аминопропильная группа переносится на полиамины типа путресцина, спермина и спермидина, занимающих существенное место в формировании структур рибосом.

Также было установлено, что спермидин и спермин обладают анальгезирующими и противовоспалительными свойства [63].
     Помимо гепатопротекторного действия адеметионин проявляет антидепрессивное действие [6,27,41,42].
     В Европе адеметионин применяется в качестве антидепрессанта уже более 30 лет [43,44,45,46]. В США же он стал популярным в качестве средства, для улучшения настроения начиная с 1998-1999 гг., после регистрации в качестве безрецептурной диетической добавки [47,48,74,75].
     Примечательно, что именно антидепрессивный эффект адеметионина был описан в первых клинических наблюдениях [78,81,82,83].
     В дальнейшем эффективность и безопасность адеметионина в редукции симптомов депрессии была достаточно убедительно продемонстрирована в многочисленных клинических испытаниях [91,99,104].
     Современные фармакологические подходы к лечению депрессии основываются на гипотезе о том, что расстройства настроения связаны с гетерогенными нарушениями регуляции системы биогенных аминов. Норадреналин и серотонин (5-гидрокситриптамин) - два нейромедиатора, в наибольшей степени, обусловливающие патофизиологические проявления расстройств настроения [76,84, 86].
     Опосредованное адеметионином трансметилирование играет ключевую роль в синтезе/инактивации в центральной нервной системе (ЦНС) нейротрансмиттеров (нейромедиаторов) - норадреналина, адреналина, допамина, серотонина, гистамина [49,107]. Акцепторами метильной группы адеметионина в ЦНС являются также жирные кислоты, фосфолипиды и многие другие соединения [78, 105, 106].
     В настоящее время считают, что антидепрессивный эффект адеметионина обусловлен его влиянием на метаболизм нейротрансмиттеров, текучесть мембран нервных клеток и активность рецепторов [53,54].

Кроме того, следует отметить, что метаболический путь образования адеметионина из аминокислоты L-метионин требует, помимо прочего, адекватной концентрации в организме фолиевой кислоты и витамина B₁₂ [36].
     Известно, что дефицит этих витаминов также ассоциирован с депрессией [37].
     К примеру, у 10-30% пациентов с депрессией наблюдается снижение концентрации фолиевой кислоты, и такие пациенты хуже отвечают на терапию антидепрессантами, а дефицит витамина B₁₂ (который также участвует в синтезе различных нейротрансмиттеров в ЦНС) может стать причиной более раннего возникновения депрессии [3, 31].
     Считают, что общим медиатором этих неблагоприятных эффектов может быть снижение в организме концентрации адеметионина [32,96,104].
     Связь адеметионина с настроением и его антидепрессивный эффект подтверждаются рядом интересных наблюдений.
     Так, у пациентов с депрессией Т. Боттиглиери регистрировал снижение концентрации адеметионина в спинномозговой жидкости. В другом исследовании у пациентов с депрессией также выявлено снижение активности фермента адеметионинсинтетазы, который вовлечен в синтез адеметионина [30].
     И, наоборот, в исследовании К.М. Беллом описана положительная корреляция между повышением концентрации адеметионина в плазме крови и уменьшением выраженности симптомов депрессии в ответ на терапию адеметионином и традиционным трициклическим антидепрессантом дезипрамином [81].
     В США S-аденозилметионин продается как пищевая добавка под торговой маркой SAM-e. Также продается и под другими торговыми марками: Gumbaral, Samyr, Adomet, Heptral and Admethionine [33]. В России, Италии и Германии -продается по рецепту.
     Недостатками препарата являются относительная дороговизна, а также химическая нестабильность (малый срок хранения и постепенный распад действующего вещества).

В настоящее время адеметионин в ряде стран выпускается в виде кишечнорастворимых таблеток и лиофилизированного порошка для инфузионного применения (таблица 1).
     Таблица 1 - Некоторые сведения о производителях, формах выпуска и

субстанциях адеметионина

  Фирма-производитель        Торговое название         Соль адеметионина   
лекарственного средства                                   в препарате      
ЛЭНС-ФАРМ               Гептор, 400 мг, амп.        S-аденозилметионин     
(Россия)                Гептор, порошок для приго-  (внутренняя соль)      
                        товления раствора для внут- растворитель - лизин   
                        ривенного и внутримышеч-                           
                        ного введения, 400 мг, фл.                         
ВЕРОФАРМ                Гептор, 400 мг, табл.       S-аденозилметионин     
(Россия)                Гептор, фл. 400 мг          (внутренняя соль)      
                        Гептордейли, 200мг, табл.                          
ЭББОТ/ABBOTT            Гептрал, 400 мг, амп.       S-аденозилметионина    
(США)                   Гептрал, 400 мг, табл.      1,4- бутандисульфонат  
                        Гептрал, порошок для        с растворителем - L-   
                        инъекций, 400 мг            лизин                  
                        Гептрал 400 мг порошок для                         
                        приготовления раствора для                         
                        внутривенного и внутримы-                          
                        шечного введения, фл.                              
ЭББОТТ С.П.А,           Гептрал, табл., покрытые    S-аденозилметионин в   
(ИТАЛИЯ)                кишечнорастворимой          виде соли с 1,4- бутан-
                        оболочкой, 400 мг           дисульфокислотой       
                        Гептрал, лиофилизат, фл.                           
                        400 мг                                             
ХОСПИРА/HOSPIRA         Гептрал, 400 мг, амп.       S-аденозилметионина    
(США)                   Гептрал, 400 мг, табл.      1,4-бутандисульфонат   
                        Гептрал, фл. 400 мг                                
                        Гептрал порошок для                                
                        инъекций, 400 мг                                   
ФАМАР/FAMAR             Гептрал, 400 мг, амп.       S-аденозилметионина    
(Франция)               Гептрал 400 мг, порошок     1,4-бутандисульфонат   
                        для приготовления раствора  с растворителем -L-    
                        для внутривенного и         лизин                  
                        внутримышечного                                    
                        введения, фл.                                      
        ЭКОМИР          Гептордейли, 200 мг, табл.  S-аденозилметионин     
       (Россия)                                     (внутренняя соль)      

Оральные формы применения

     При оральном применении SAM пик концентрации вещества препарата в плазме достигается через 3-5 часов после употребления таблетки (400-1000 мг) [79,80,81].
     При лечении остеоартрита может потребоваться до одного месяца лечения для достижения желаемого эффекта. Применяют следующие формы SAM для внутреннего применения: тозилат, бутандисульфонат, дисульфат тозилат, дисульфат дитозилат, и дисульфат монотозилат [85,97, 96].
     Инъекционные формы
     В России доступен инъекционный SAMe (Гептрал) [86]. Следует отметить гораздо более высокую биодоступность препарата при парентеральном введении (96% против 5% оральной формы) [87].

        1.3      Физико-химические свойства адеметионин-иона

     S-аденозилметионин (SAM, SAMe, SAM-e, адеметионин) - это кофермент, принимающий участие в реакциях переноса метильных групп [102]. Впервые был описан в Италии ученым Дж. Кантони в 1952 году [35]. Молекулярная масса 399,447 г/моль.

        1.3.1 Физические свойства адеметионин-иона

     Белый аморфный порошок, умеренно растворим в метаноле, практически нерастворим в воде. Из-за быстрого разложения адеметионин-иона физические константы не установлены [25].

        1.3.2 Химические свойства адеметионин-иона


^)-5'-[(3-Амино-3-карбоксипропил)метилсульфонио]-5-дезоксиаденозин гидроксид (внутренняя соль).

Адеметионин-ион представляет собой гидрофобный аденин серосодержащий нуклеозид, в котором гидроксильная группа в рибозе в положении 5' заменена на остаток молекулы L-метионина.
     Наличие в молекуле адеметионин-иона двух первичных и четырех третичных атомов азота обуславливает его основные свойства. Таким образом, молекула адеметионин-иона может присоединить от одного до 6 протонов. Данное свойство используется для повышения стабильности адеметионин-иона [126].
     Считается, что для стабильности необходимо присоединить от 4 до 6 атомов водорода, предпочтительно 5 [132].
     Окислительно-восстановительные свойства адеметионина обусловлены наличием в молекуле адеметионина атома серы. Данные свойства используются для качественного анализа адеметионина [35].
     Метильная группа (-CH3), которая присоединена к атому серы в молекуле метионина в составе S-аденозилметионина является химически активной, поэтому она может быть перенесена на молекулу субстрата в трансметилазной реакции. Более сорока метаболических реакций требуют переноса метильной группы от S-аденозилметионина на такие субстраты, как нуклеиновые кислоты, белки и липиды [69].

        1.4       Методы качественного и количественного анализа адеметионин-иона и его препаратов

     Идентификацию адеметионин-иона проводят следующими методами:
     1.        Химические реакции. Для проведения реакции адеметионин-иона с нитропруссидом натрия, а также с нингидрином, предварительно требуется гидролизовать адеметионин-ион при рН среды 5,0 в течение 30 минут при температуре 100 °С.
     По реакции с нитропруссидом натрия подтверждают наличие атома серы. В результате реакции образуется продукт, имеющий красно-фиолетовую окраску.