Вестник Роcсийской академии медицинских наук, 2016, том 71, № 1

Научно-теоретический журнал. Выходит один раз в два месяца. Основан в 1946 г.

Входит в Перечень ведущих научных журналов и изданий ВАК
Учредитель — Роcсийская академия медицинских наук

Главный редактор И.И. ДЕДОВ

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ:
Э.К. АЙЛАМАЗЯН, А.И. АРЧАКОВ, Л.И. АФТАНАС, А.А. БАРАНОВ, В.В. БЕРЕГОВЫХ (зам. гл. редактора), 
Л.А. БОКЕРИЯ, Н.Н. ВОЛОДИН, Н.Ф. ГЕРАСИМЕНКО, Е.К. ГИНТЕР, П.В. ГЛЫБОЧКО, Е.З. ГОЛУХОВА, 
В.В. ЗВЕРЕВ, Р.С. КАРПОВ, С.И. КОЛЕСНИКОВ, В.В. КУХАРЧУК. Г.А. МЕЛЬНИЧЕНКО, Н.А. МУХИН, 
Е.Л. НАСОНОВ, Г.Г. ОНИЩЕНКО, В.И. ПЕТРОВ, В.И. ПОКРОВСКИЙ, В.П. ПУЗЫРЁВ, В.Г. САВЧЕНКО, 
В.И. СЕРГИЕНКО, Г.А. СОФРОНОВ, В.И. СТАРОДУБОВ, Г.Т. СУХИХ, В.А. ТУТЕЛЬЯН (зам. гл. редактора), 
И.Б. УШАКОВ, Р.М. ХАИТОВ, Е.И. ЧАЗОВ, В.П. ЧЕХОНИН, В.И. ЧИССОВ, Е.В. ШЛЯХТО

НАУЧНЫЙ РЕДАКТОР:  А.А. КУБАНОВ

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ
АКАДЕМИИ
МЕДИЦИНСКИХ НАУК

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Журнал «Вестник Российской академии медицинских наук» зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере связи, 
информационных технологий и массовых коммуникаций 16.09.1992 г. Регистрационный номер 01574.

Редакция не несет ответственности за содержание рекламных материалов. 
Воспроизведение или использование другим способом любой части издания без согласия редакции 
является незаконным и влечет за собой ответственность, установленную действующим законодательством РФ 

Тираж 1000 экз. Подписные индексы: в агентстве Роспечать — 71488, в агентстве «Пресса России» — 38814

Издательство «ПедиатрЪ»: 119991, Москва, Ломоносовский пр-т, 2/62, тел./факс: +7 (499) 132-30-43, http://vestnikramn.spr-journal.ru
e-mail: vestnikramn@nczd.ru 
ООО «ХОМОПРИНТ»: 117623, Москва, ул. Типографская, д. 10

2016/том 71/№1

ISSN 0869-6074

Published bimonthly. Founded in 1946. 

The Journal is in the List of the leading scientific journals and publications 
of the Supreme Examination Board (VAK)
Founder — The Russian Academy of Medical Sciences

Editor-in-chief I.I. Dedov

EDITORIAL BOARD:
E.K. AILAMAZYAN, A.I. ARCHAKOV, L.I. AFTANAS, A.A. BARANOV, V.V. BEREGOVYKH (deputy editors-in-chief), 
L.A. BOKERIYA, N.N. VOLODIN, N.F. GERASIMENKO, E.K. GINTHER, P.V. GLYBOCHKO, L.Z. GOLUKHOVA, 
V.V. ZVEREV, R.S. KARPOV, S.I. KOLESNIKOV, V.V. KUKHARCHUK, G.A. MELNICHENKO, N.A. MUKHIN, 
E.L. NASONOV, I.I. ONISHCHENKO, V.I. PETROV, V.I. POKROVSKII, V.P. PUZYREV, V.G. SAVCHENKO, 
V.I. SERGIENKO, G.A. SOFRONOV, V.I. STARODUBOV, G.T. SUKHIKH, V.A. TUTELYAN (deputy editors-in-chief), 
I.B. USHAKOV, R.M. KHAITOV, E.I. CHAZOV, V.P. CHEKHONIN, V.I. CHISSOV, E.V. SHLYAKHTO

RESEARCH EDITOR:  A.A. KUBANOV

ANNALS OF THE RUSSIAN 
ACADEMY
OF MEDICAL SCIENCES

THE RUSSIAN ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES

Mass media registration certificate dated September, 16, 1992. Series № 01574 Federal service for surveillance over non-violation 
of the legislation in the sphere of mass communications and protection of cultural heritage.

Editorial office takes no responsibility for the contents of advertising material.
No part of this issue may be reproduced without permission from the publisher. While reprinting publications one must make reference 
to the journal « Annals Of The Russian Academy Of Medical Sciences »

Edition 1000 copies. Subscription indices are in the catalogue «Rospechat» 71488

Publisher «PEDIATR»: 2/62, Lomonosov avenue, Moscow, 119991, tel./fax: +7 (499) 132-30-43, http://vestnikramn.spr-journal.ru
e-mail: vestnikramn@nczd.ru 
Printed in the printing office «KHOMOPRINT», 10, Tipografskaya st., Moscow, 117623

2016/ 71 (1)

ISSN 0869-6074

СОДЕРЖАНИЕ
CONTENTS

5

11

16

25

31

41

46

52

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИНФЕКЦИОННЫХ 
БОЛЕЗНЕЙ

А.А. 
Калошин, 
Е.И. 
Леонова, 
А.В. 
Солдатенкова, 
Н.А. Михайлова Исследование протективных свойств 
рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны и анатоксина Pseudomonas aeruginosa
Л.И. Колесникова, М.А. Даренская, М.А. Рашидова, 
Л.Ф. Шолохов, 
Л.А. 
Гребёнкина, 
О.А. 
Вантеева 
Состояние липоперекисных процессов у женщин 
репродуктивного возраста, больных острой формой 
вирусного гепатита

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ КАРДИОЛОГИИ
И СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ

О.С. Левченкова, В.Е. Новиков Возможности фармакологического прекондиционирования
Л.Н. Маслов, С.Ю. Цибульников, А.В. Мухомедзянов, 
А.С. Семенцов, 
А.В. 
Цепокина, 
М.В. 
Хуторная, 
А.Г. Кутихин, И.Ф. Нам Посткондиционирование 
сердца: анализ экспериментальных и клинических 
данных
В.А. Бывальцев, Е.Г. Белых, И.А. Степанов Выбор способа 
лечения церебральных аневризм различных локализаций в условиях развития современных эндоваскулярных технологий: метаанализ

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ НЕВРОЛОГИИ
И НЕЙРОХИРУРГИИ

Л.В. Поскотинова, Е.В. Кривоногова, Н.М. Хасанова, 
М.Н. Красникова Возможность прогноза моторных и когнитивных нарушений по данным межполушарной асимметрии когнитивного вызванного 
потенциала Р300 и симптомокомплекса при болезни 
Паркинсона

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
ПАТОФИЗИОЛОГИИ

В.Н. Сахаров, П.Ф. Литвицкий Нестабильность конформации белка ― общий компонент патогенеза болезней человека

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
ПЕДИАТРИИ

А.В. Грибанов, Ю.С. Джос Половые различия спектральных характеристик фоновой ЭЭГ у детей младшего 
школьного возраста

INFECTIOUS DISEASES: 
CURRENT ISSUES

A.A. Kaloshin, E.I. Leonova, A.V. Soldatenkova, N.A.Mihailova 
Assessment of Protective Properties of the Recombinant 
Complex of the Outer Membrane Protein F and the 
Toxoid of Pseudomonas aeruginosa
L.I. Kolesnikova, M.A. Darenskaya, M.A. Rashidova, 
L.F. Sholokhov, L.A. Grebenkina, O.A. Vanteeva Lipid 
Peroxidation State in Women of Reproductive Age with 
Acute Form of Viral Hepatitis

CARDIOLOGY AND CARDIOVASCULAR SURGERY: 
CURRENT ISSUES

O.S. 
Levchenkova, 
V.E. 
Novikov 
Possibilities 
of 
Pharmacological Preconditioning
L.N. Maslov, S.Yu. Tsibul’nikov, A.V. Mukhomedzyanov, 
A.S. Sementsov, A.V. Tsepokina, M.V. Khutornaya, 
A.G. Kutikhin, I.F. Nam Postconditioning the Heart: 
Analysis of Experimental and Clinical Data

V.A. Byval’tsev, E.G. Belykh, I.A. Stepanov The Choice 
of the Treatment Method for Cerebral Aneurysms of 
Diff erent Locations in the Era of Advanced Endovascular 
Technologies: A Meta-Analysis

NEUROLOGY AND NEUROSURGERY:
CURRENT ISSUES

L.V. Poskotinova, E.V. Krivonogova, N.M. Khasanova, 
M.N. Krasnikova The Predictability of Motor and 
Cognitive Impairment According to Brain Asymmetry 
of Cognitive Evoked Potentials P300 and Features 
of Symptom Complex in Patients with Parkinson’s 
Disease

РATHOPHYSIOLOGY:
CURRENT ISSUES

V.N. Sakharov, P.F. Litvitskiy Disorders of Protein 
Conformation as a Typical Component of Various 
Human Disease Pathogenesis

PEDIATRICS: 
CURRENT ISSUES

A.V. Gribanov, Y.S. Dzhos Sex Diff erences of Spectral 
Characteristics of Baseline EEG in Primary School-Aged 
Children

СОДЕРЖАНИЕ

D.Yu. Ovsyannikov, E.V. Stepanova, M.A. Belyashova, 
E.A. Degtyareva Jeune Syndrome: Case Series Report

M.A. Snovskaya, L.S. Namazova-Baranova, E.L. Semikina, 
S.G. Makarova, O.V. Kozhevnikova, A.S. Batyrova, 
A.A. Marushina 
Age-specifi c 
Epidemiology 
of 
the 
Antibody Response Prevalence in Children with Food 
Allergy

STATUS OF MEDICAL SCIENCE

M.V. Zueva Fundamental Sciences and Fundamental 
Medicine

ANNIVERSARIES, CONGRATULATIONS

Ivan Ivanovich Dedov
David Georgievich Zaridze
Natal'ya Valentinovna Polunina
Mikhail Fedosovich Savchenkov

Д.Ю. Овсянников, Е.В. Степанова, М.А. Беляшова, 
Е.А. Дегтярёва Синдром Жёна: описание серии 
наблюдений
М.А. 
Сновская, 
Л.С., 
Намазова-Баранова, 
Е.Л. Семикина, С.Г. Макарова, О.В. Кожевникова, 
А.С.  Батырова, А.А. Марушина Возрастная эпидемиология распространенности антительного ответа
у детей с пищевой аллергией

СОСТОЯНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

М.В. Зуева Фундаментальные науки и фундаментальная 
медицина

ЮБИЛЕИ

Иван Иванович Дедов
Давид Георгиевич Заридзе
Наталья Валентиновна Полунина
Михаил Федосович Савченков

61

68

77

84
86
88
90

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

DOI: 10.15690/vramn584
А.А. Калошин, Е.И. Леонова, А.В. Солдатенкова, Н.А. Михайлова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва, Российская Федерация
Исследование протективных свойств 
рекомбинантного комплекса
белка F наружной мембраны и анатоксина 
Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa вызывает осложнения после ожогов, травм и хирургических вмешательств, являясь одной из основных причин 
нозокомиальных инфекций. Этот патоген обладает высокой резистентностью к большинству антибактериальных средств, поэтому 
иммунопрофилактика рассматривается как один из приоритетных подходов для борьбы с синегнойной инфекцией. Цель исследования: 
изучить защитные свойства рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны (OprF) и атоксической формы экзотоксина А 
(анатоксина) от экспериментальной синегнойной инфекции. Методы. Рекомбинантные белки, содержащие дополнительную шестигистидиновую последовательность, синтезировали в клетках Escherichia coli c помощью изопропил-β-d-тиогалактопиранозида и 
очищали методом аффинной хроматографии с использованием Ni-сефарозы. Внутрибрюшинно иммунизировали мышей препаратами 
рекомбинантных белков. В качестве адъюванта использовали гидроксид алюминия. Экспериментальное заражение осуществляли 
внутрибрюшинным введением живой вирулентной культуры P. aeruginosa штамма РА103. Результаты. При двукратной иммунизации 
мышей комплексом, содержащим 25 мкг OprF и 50 мкг анатоксина, выявлен наилучший протективный эффект (индекс эффективности защитных свойств в этом случае составил 4,0). Индексы эффективности для рекомбинантных белков, вводимых двукратно в тех 
же дозах по отдельности, соответствовали 2,0 для OprF и 2,3 для анатоксина и не увеличивались после трехкратной иммунизации 
животных. Уменьшение в два раза доз (12,5 мкг OprF и 25 мкг анатоксина) при трехкратном введении способствовало увеличению 
выживаемости мышей, иммунизированных отдельными белками (индексы эффективности ― 3 для OprF и 3,5 для анатоксина), однако 
при введении комплекса белков в тех же дозах индекс эффективности не увеличился и составил 2,8. Заключение. Показано, что максимальный протективный эффект формируется в короткие сроки при использовании комплексной иммунизации двумя рекомбинантными 
белками OprF и анатоксином в дозах 25 и 50 мкг.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, белок F наружной мембраны, экзотоксин А, анатоксин.
(Для цитирования: Калошин А.А., Леонова Е.И., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств 
рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны и анатоксина Pseudomonas aeruginosa. Вестник РАМН. 2016;71(1):5–10. 
doi: 10.15690/vramn584)

A.A. Kaloshin, E.I. Leonova, A.V. Soldatenkova, N.A.Mihailova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russian Federation
Assessment of Protective Properties of the Recombinant Complex
of the Outer Membrane Protein F
and the Toxoid of Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa induces the complications after burns, injuries, surgical interventions and appears to be one of the main causative agents 
of nosocomial infections. This pathogen has the high resistance to the antibacterial preparations, therefore the immunoprophylaxis is considered 
as one of the major approaches to reduce Pseudomonas infection. Objective: The aim of our investigation is to study the protective properties of the 
recombinant complex of the outer membrane protein F (OprF) and a non-toxic variant of the exotoxin A (toxoid) against Pseudomonas infection. 
Methods: The recombinant proteins which contained the additional histidine residues were synthesized into Escherichia coli with isopropyl-βD-thyogalactopyranoside (IPTG). The recombinant proteins were purified by affinity chromatography on Ni-Sepharose. The preparations of 
recombinant proteins were injected intraperitoneally into the mice. Aluminum hydroxide was used as an adjuvant. For an experimental infection 
in mice, animals were challenged intraperitoneally by a live virulent culture of P. aeruginosa (PA-103 strain). Results: The best protective effect 
for the complex containing 25 μg OprF and 50 μg toxoid was identified when we used the double immunization of mice (Index of efficiency of the 
protective properties in this case was 4.0). Indexes of efficiency of separated recombinant proteins which were injected twice in the same doses 
were 2.0 for OprF и 2.3 for toxoid. The triple immunization of animals was inefficient for separated recombinant proteins in the same doses. The 
injection of doses which were lowered twice (12.5 μg for OprF and 25 μg for toxoid) resulted in increased survival of mice immunized by individual 
proteins (indexes of efficiency: 3 for OprF and и 3,5 for toxoid). However when we administered to the complex of proteins with the same doses 
Index of efficiency was 2.8. Conclusion: It was shown that the maximum protective effect in a short time is achieved by the combination of double 
immunization and the mixture of the recombinant proteins OprF and the 25 and 50 μg doses of recombinant toxoid .

Key words: Pseudomonas aeruginosa, outer membrane protein F (OprF), exotoxin A, toxoid.
(For citation: Kaloshin AA, Leonova EI, Soldatenkova AV, Mihailova NA. Assessment Protective Properties of the Recombinant 
Complex of the Outer Membrane Protein F and the Toxoid of Pseudomonas aeruginosa. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 
2016;71(1):5–10. doi: 10.15690/vramn584)

ВЕСТНИК РАМН /2016/ 71 (1)

Обоснование

Условно-патогенный микроорганизм Pseudomonas 
aeruginosa (синегнойная палочка) является одной из основных причин нозокомиальных инфекций. Этот патоген 
часто вызывает осложнения после ожогов, травм и хирургических вмешательств. Особенностью P. aeruginosa является высокая резистентность практически всех штаммов к 
большинству применяемых в клинике антибиотиков, что 
обусловливает трудность терапии синегнойной инфекции 
в условиях стационара [1−3]. Иммунопрофилактика может рассматриваться как один из приоритетных подходов 
для эрадикации возбудителя.
В Советском Союзе разработкой вакцин против синегнойной инфекции занимались с середины прошлого 
века. При этом использовали как инактивированные 
цельные культуры [4], так и компоненты бактериальных 
клеток [5]. Эти вакцины не были разрешены для использования в клинике, поскольку содержали массу токсических компонентов. Для устранения нежелательных 
побочных эффектов в дальнейшем проводились исследования по созданию препаратов, содержащих выделенные 
и очищенные протективные белки наружной мембраны 
[6, 7]. Однако процесс получения очищенных белков 
трудоемок и сложен. Преодолеть классические технологические трудности позволяет использование генно-инженерных технологий. 
В лаборатории протективных антигенов ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» получена и исследована рекомбинантная форма белка F наружной мембраны (OprF) 
P. aeruginosa. Этот консервативный и иммуногенный 
белок, участвующий в формировании пор, является чрезвычайно важным для жизнедеятельности бактерии [8]. 
Показано, что рекомбинантный белок OprF обладает 
антигенными свойствами и защищает мышей от экспериментальной синегнойной инфекции, вызываемой 
нетоксигенным штаммом [9]. 
Одним из наиболее значимых факторов патогенности 
синегнойной палочки является экзотоксин А, блокирующий синтез белков в клетках млекопитающих. Именно 
поэтому для эффективной иммунологической защиты 
организма от P. aeruginosa, кроме присутствия антител, 
связывающихся с поверхностными антигенами микроорганизма, важно достаточное содержание антител для 
нейтрализации молекул токсина, продуцируемого бактериями [10]. 
Нами были получены рекомбинантные формы экзотоксина А P. aeruginosa и выявлено, что атоксическая 
форма (анатоксин) защищала мышей от введения летальных доз функционального рекомбинантного экзотоксина А P. aeruginosa [11].
Результаты испытаний протективных свойств рекомбинантных OprF и анатоксина позволили приступить к 
исследованию их комплексного применения с целью защиты от штамма синегнойной палочки, секретирующего 
экзотоксин А. 
Цель исследования: оценить результаты комплексного 
применения рекомбинантных OprF и анатоксина с целью 
защиты от штамма синегнойной палочки, секретирующего экзотоксин А.

Методы

Дизайн исследования
Проведено экспериментальное контролируемое проспективное исследование с целью получения и очистки 

рекомбинантных белков, оценки их защитных свойств по 
отдельности и в комплексе при двукратной и трехкратной 
иммунизации.

Условия проведения
Исследования проводились в лаборатории протективных антигенов и клинике лабораторных животных ФГБУ 
«НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова».

Продолжительность исследования
Исследования проводились с февраля 2014 по май 
2015 г. 

Методы регистрации исходов
Синтез рекомбинантных белков проводили путем индукции экспрессии с помощью изопропил-β-dтиогалактопиранозида (ИПТГ). Очистку рекомбинантного белка осуществляли методом аффинной хроматографии 
с использованием Ni-сефарозы (Amercham, США) в 8 М 
буферном растворе мочевины. Биомассу, содержащую 
рекомбинантный белок, денатурировали в растворе следующего состава: 8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М 
Трис; рН 8,0. Денатурацию осуществляли в течение ночи 
при комнатной температуре в шейкере (Ecotron, Швейцария) с частотой вращения 120−160 об/мин. Затем с целью 
удаления нерастворившихся компонентов клеток полученный лизат дважды центрифугировали со скоростью 
16 000 g при комнатной температуре в течение 20−30 мин. 
Лизат переносили в колбу, добавляли к нему суспензию 
Ni-сефарозы и инкубировали 2 ч при комнатной температуре в шейкере с легким покачиванием (40 об/мин). 
Полученную суспензию пропускали через колонку (BioRad, США). С использованием хроматографической системы Biologic LP (Bio-Rad) проводили отмывку сорбента 
со связавшимся белком. Использовали тот же буфер, 
который применяли при растворении биомассы, но с pH 
6,3, а затем с pH 5,9. Элюцию проводили аналогичным 
буферным раствором с pH 4,5.
Для перевода белков в нативное состояние использовали ступенчатый диализ против физиологического 
раствора, содержащего 6, 4, 2 и 1 М мочевину. На конечном этапе диализ проводили против физиологического 
раствора без мочевины. Содержание белков определяли 
при длине волны 280 нм в спектрофотометре Genesys 6 
(Thermo Scientific, США). При расчете концентрации рекомбинантных белков использовали следующие коэффициенты экстинкции: 0,7 для OprF и 0,73 для анатоксина, 
вычисленные в программе OMIGA 2.0 software (http://
www.highbeam.com/doc/1G1-61963309.html). Анализ белковых продуктов проводили в приборе для капиллярного 
электрофореза QIAxсel Advanced (QIAGEN, Германия). 
Рекомбинантные белки для иммунизации животных 
разводили в физиологическом растворе, добавляли гель 
гидроксида алюминия в соотношении 1 мг Al(OH)3 на 
1 мг белка и проводили сорбцию в течение 12 ч при 
температуре 4 °С. Препараты в объеме 0,5 мл вводили 
внутрибрюшинно мышам массой 16−18 г. При индукции 
экспериментальной инфекции через 2 нед после последней иммунизации животных заражали внутрибрюшинно 
живой вирулентной культурой P. aeruginosa штамма 
РА-103 в объеме 0,5 мл. Подсчет погибших животных 
проводили в течение 7 дней. 

Этическая экспертиза
Все работы с животными проводили в соответствии с 
положениями «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Статистический анализ
ЛД50 вычисляли по формуле Кербера в модификации 
Ашмарина−Воробьева: 
ЛД50 =IgA-Ig4 (B1 /C1 + B2 /C2 + B3 /C3 ) – 0,5,
где А — максимальная инфекционная доза в опыте, В — 
количество животных, павших в группе, С — первоначальное количество животных в группе. 
Cтандартную ошибку ЛД50 (SЛД50) вычисляли по следующей формуле: 
SЛД50 = (ЛД84-ЛД16 ): Δ (2×N),
где N ― количество животных в группе. ЛД84 и ЛД16 рассчитывали с использованием пробит-анализа [12].

Результаты

Рекомбинантные белки OprF (Mr 38,9 кДа) и анатоксин (Mr 65,8 кДа) получены в очищенном виде в результа
те аффинной хроматографии в колонках с никельактивированным сорбентом (рис.). На первом этапе очищенные 
рекомбинантные белки использовали для двукратной 
иммунизации мышей. Четырем группам животных вводили рекомбинантные белки по отдельности в дозах 25 или 
50 мкг. Мыши пятой группы получали смесь двух белков: 
25 мкг рекомбинантного OprF и 50 мкг рекомбинантного 
анатоксина. Интервал между иммунизациями составлял 
2 нед. После курса иммунизации животным вводили от 
12,5 до 200 млн микробных клеток (мк) живой культуры 
P. aeruginosa. Животных контрольной группы (мыши той 
же партии, которым вводили физиологический раствор 
хлорида натрия) заражали дозами от 6,25 до 100 млн мк. 
ЛД50 для группы интактных мышей составила 19 млн 
мк. В группе животных, иммунизированных рекомбинантным OprF в дозе 25 мкг, ЛД50 составила 37,9 млн 
мк; для животных, иммунизированных рекомбинантным 
анатоксином в дозе 50 мкг, это значение соответствовало 

Рис. Анализ белковых продуктов, полученных в результате очистки рекомбинантных белков OprF (A) и анатоксина (B); C ― весовой 
белковый маркер
Примечание. Отмечены размеры фрагментов весового белкового маркера в капилляре С: 14, 20, 30, 45, 66 и 97 кДа. В каждом капилляре 
присутствовал туннельный маркер: два фрагмента размерами 1 и 130 кДа.

A)

В)

С)

ВЕСТНИК РАМН /2016/ 71 (1)

41,8 млн мк. Использование рекомбинантного OprF в 
дозе 50 мкг не выявило преимуществ (ЛД50 33 млн мк). 
Иммунизация животных 25 мкг рекомбинантного анатоксина оказалась недостаточно эффективной (ЛД50 28,7 млн 
мк). Наилучший результат (ЛД50 75,8 млн мк) выявлен 
при комплексной иммунизации обоими рекомбинантными белками (табл. 1).
Далее была проведена трехкратная иммунизация 
трех групп мышей: рекомбинантным OprF в дозе 25 мкг, 

рекомбинантным анатоксином в дозе 50 мкг и их комплексом, содержащим те же дозы активных компонентов. Как оказалось, данная иммунизационная схема 
не была эффективной во всех вариантах. Значения 
ЛД50 для животных иммунизированных групп составили 27,4 млн мк для рекомбинантного OprF, 32,2 млн 
мк для рекомбинантного анатоксина и 28,7 млн мк 
для комплекса. ЛД50 в контрольной группе составила 
19 млн мк (табл. 2). 

Таблица 1. Защитные свойства рекомбинантных OprF и анатоксина при двукратной иммунизации

Вводимые препараты
 (доза)
Доза заражения,
млн мк
Количество мышей павших/
выживших, n
ЛД50±SЛД50,
млн мк
ИЭ

OprF ― 25 мкг,
гидроксид алюминия ― 25 мкг

200
10/0

37,9±11,3
2,0
50
5/5

12,5
2/8

OprF ― 50 мкг,
гидроксид алюминия ― 50 мкг

200
10/0

33±10,1
1,7
50
6/4

12,5
2/8

Анатоксин ― 25 мкг,
гидроксид алюминия ― 25 мкг

200
10/0

28,7±8,4
1,5
50
9/1

12,5
5/5

Анатоксин ― 50 мкг,
гидроксид алюминия ― 50 мкг

200
9/1

41,8±10,6
2,3
50
5/5

12,5
2/8

OprF ― 25 мкг,
анатоксин ― 50 мкг,
гидроксид алюминия ― 75 мкг

200
6/4

75,8±22,1
4,0
50
4/6

12,5
2/8

Контроль (физ. р-р)

100
9/1

19±5,0
25
6/4

6,25
2/8

Примечание. ИЭ ― индекс эффективности.

Таблица 2. Защитные свойства рекомбинантных OprF и анатоксина при трехкратной иммунизации

Вводимые препараты 
(доза)
Доза заражения,
млн мк
Количество мышей павших/
выживших, n
ЛД50±SЛД50,
млн мк
ИЭ

OprF ― 25 мкг,
гидроксид алюминия ― 25 мкг

200
10/0

27,4±6,6
1,4
50
11/4

12,5
2/8

Анатоксин ― 50 мкг,
гидроксид алюминия ― 50 мкг

200
10/0

32,2±10,1
1,7
50
5/7

12,5
4/6

OprF ― 25 мкг,
анатоксин ― 50 мкг,
гидроксид алюминия ― 75 мкг

200
10/0

28,7±7,6
1,5
50
9/6

12,5
3/7

Контроль (физ. р-р)

100
10/0

19±5,0
25
7/3

6,25
0/10

Примечание. ИЭ ― индекс эффективности.

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Таблица 3. Защитные свойства рекомбинантных OprF и анатоксина с уменьшенными дозами при трехкратной иммунизации

Вводимые препараты (доза)
Доза заражения,
млн мк
Количество мышей павших/
выживших, n
ЛД50±SЛД50,
млн мк
ИЭ

OprF ― 12,5 мкг,
гидроксид алюминия ― 12,5 мкг

200
10/0

57,4±11,7
3
50
4/6

12,5
0/10

Анатоксин ― 25 мкг,
гидроксид алюминия ― 25 мкг

200
1/9

66±13,7
3,5
50
4/6

12,5
0/10

OprF ― 12,5 мкг,
анатоксин ― 25 мкг,
гидроксид алюминия ― 37,5 мкг

200
12/1

57,4±12,4
2,8
50
5/8

12,5
2/11

Контроль (физ. р-р)

100
10/0

19±5,0
25
6/4

6,25
1/9

Примечание. ИЭ ― индекс эффективности.

На последнем этапе проведена трехкратная иммунизация животных с использованием уменьшенных доз 
рекомбинантных белков. Для этого мышам первой группы вводили 12,5 мкг рекомбинантного OprF, мышам 
второй группы ― 25 мкг рекомбинантного анатоксина, 
третьей группы ― 12,5 мкг OprF и 25 мкг анатоксина. 
При данной схеме выявлено существенное увеличение 
выживаемости мышей, иммунизированных отдельными 
рекомбинантными белками: в группе иммунизированных 
рекомбинантным OprF ЛД50 составляла 57,4 млн мк, а для 
животных, иммунизированных рекомбинантным анатоксином, ― 66 млн мк. При этом иммунизация двумя белками одновременно по данной схеме не способствовала 
увеличению защитных свойств (ЛД50 57,4 млн мк; табл. 3).

Обсуждение

Ранее показано, что рекомбинантный OprF обладал защитными свойствами от экспериментальной инфекции, 
вызываемой живой вирулентной культурой P. aeruginosa 
штамма PA-170015, не секретирующего экзотоксин А [4], 
а рекомбинантный анатоксин ― от рекомбинантного 
функционального экзотоксина А [7]. Оптимальные иммунизирующие дозы на одно животное (при двукратном 
введении) составляли 25 мкг OprF и 50 мкг для анатоксина, поэтому их использовали при получении комплексного препарата. 
В проведенных экспериментах оба рекомбинантных 
белка проявили защитные свойства от P. aeruginosa штамма РА-103, обладающего высоким уровнем синтеза экзотоксинов. Кроме того, подтверждены оптимальные 
дозы применяемых белков при двукратной иммунизации. 
Индексы эффективности (ИЭ) защитных свойств (отношение ЛД50 для иммунизированных мышей к ЛД50 в 
контрольной группе) составили 2,0 для 25 мкг рекомбинантного OprF и 2,3 для 50 мкг рекомбинантного анатоксина. При комплексной иммунизации обоими рекомбинантными белками ИЭ увеличивался до 4,0 (см. табл. 1).
С целью повышения защитных свойств рекомбинантных белков была апробирована схема трехкратной иммунизации. Однако при использовании ранее подобранных 
доз, оптимальных для двукратной иммунизации, эта прививочная схема не проявила положительного эффекта. 

ИЭ протективных свойств составили 1,4 для OprF, 1,7 
для анатоксина и 1,5 для комплекса (см. табл. 2). Вполне 
вероятно, что дополнительное введение антигенов приводило к иммунодепрессии, поэтому следующим шагом при 
оптимизации иммунизационных схем стало использование уменьшенных доз рекомбинантных белков при трехкратном введении. Такая схема приводила к существенному увеличению защитных свойств при иммунизации 
мышей отдельными белками (ИЭ для OprF ― 3, ИЭ для 
анатоксина ― 3,5). В то же время комплекс двух белков 
не показал преимуществ. ИЭ в этой группе составил 2,8 
(см. табл. 3).

Заключение

На основании экспериментальных данных подтверждена эффективность использования комплексной иммунизации двумя рекомбинантными белками, которые 
способны вызывать иммунные реакции как к поверхностным антигенам микроорганизма, так и к одному из самых 
серьезных факторов патогенности возбудителя ― экзотоксину А. Однако данный факт установлен только при 
двукратной схеме иммунизации мышей в дозах введения 
OprF 25 мкг и анатоксина 50 мкг. Возможно, что при трехкратной иммунизации двумя белками низкая эффективность обусловливается излишней антигенной нагрузкой. 
Именно поэтому в дальнейшем планируется исследование комплекса рекомбинантных OprF и анатоксина с 
варьированием доз белковых препаратов и адъюванта, а 
также изучение их влияния на систему приобретенного и 
врожденного иммунитета.

Источник финансирования

Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских 
технологий» на 2014 год.

Конфликт интересов

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

ВЕСТНИК РАМН /2016/ 71 (1)

ЛИТЕРАТУРА

1. 
Falagas ME, Koletsi PK, Bliziotis IA. The diversity of definitions of 
multidrug-resistant (MDR) and pandrug-resistant (PDR) Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. J Med Microbiol. 
2006;55(12):1619–1629. doi: 10.1099/jmm.0.46747-0
2. Strateva T, Yordanov D. Pseudomonas aeruginosa ― a phenomenon of bacterial resistance. J Med Microbiol. 2009;58(9):1133–1148. 
doi: 10.1099/jmm.0.009142-0.
3. Бобровничий В.И. Современные подходы к диагностике и 
лечению синегнойной инфекции у больных муковисцидозом 
// Медицинский журнал. – 2012. – №1. – С. 4–9. [Bobrovnichii 
VI. Modern approaches to diagnosis and treatment of Pseudomonas 
aeruginosa infection in a patient with cystic fibrosis. Meditsinskii 
zhurnal. 2012;1:4–9. (In Russ).]
4. Мороз А.Ф. Применение поливалентной вакцины с защитным эффектом против Pseudomonas aeruginosa / Сб. материалов Всесоюзной конференции по ранам и раневой инфекции. – М.; 1977. С. 73–74. [Moroz AF. Primenenie polivalentnoi 
vaktsiny s zashchitnym effektom protiv Pseudomonas aeruginosa. 
(Conference proceedings) Sb. materialov Vsesoyuznoi konferentsii 
po ranam i ranevoi infektsii. Moscow; 1977. p. 73–74. (In Russ).]
5. Станиславский Е.С. и др. Бесклеточная псевдомонас-вакцина. 
Лабораторные испытания эффективности экспериментальных псевдомонас-вакцин // Журнaл микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 1982. – №10. – С. 25–29. [Stanislavskii ES, et al. Beskletochnaya psevdomonas-vaktsina. Laboratornye 
ispytaniya effektivnosti eksperimental’nykh psevdomonas-vaktsin. 
Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. 1982;10:25–29. 
(In Russ).]
6. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое 
изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa 
// Журнaл микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 
– 1996. – №2. – С. 7–9. [Makarenko TA, Stanislavskii ES. 
Immunologicheskoe 
izuchenie 
belkov 
kletochnoi 
stenki 
Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i 
immunologii. 1996;2:7–9. (In Russ).]

7. 
Kim DK, Kim JJ, Kim JH, et al. Comparison of two immunization 
schedules for a Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins vaccine in burn patients. Vaccine. 2000;19(9–10):1274–1283. 
doi:10.1016/S0264-410X(00)00235-8
8. Krishnan S, Prasadarao NV. Outer membrane protein A and OprF ― 
Versatile roles in Gramnegative bacterial infections. FEBS Journal. 
2012;279(6):919–931. doi: 10.1111/j.1742-4658.2012.08482.x.
9. Калошин А.А., Гатыпова Е.В., Михайлова Н.А. Получение рекомбинантных форм белка F наружной мембраны 
(OprF) Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммуногенных свойств // Биотехнология. – 2011. – №2. – С. 74–84. 
[Kaloshin AA, Gatypova EV, Mikhailova NA. Obtaining of Recombinant Forms of Outer Membrane Protein F from Pseudomonas 
aeruginosa and Assessment of their Immunogenic Properties. 
Biotekhnologiia (Mosc.). 2011;2:74–84. (In Russ).]
10. Вертиев Ю.В., Бродвинова Н.С., Мороз A.Ф. Экзотоксин 
А Pseudomonas aeruginosa и его роль в патогенезе синегнойной 
инфекции // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. – 1981. – №2. – С. 13–19. [Vertiev YV, Brodvinova 
NS, Moroz AF. Ekzotoksin A Pseudomonas aeruginosa i ego rol’ v 
patogeneze sinegnoinoi infektsii. Zhurnal mikrobiologii epidemiologii 
i immunologii. 1981;2:13–19. (In Russ).]
11. Калошин А.А., Исаков М.А., Михайлова Н.А., Вертиев Ю.В. 
Получение рекомбинантной атоксической формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa // Бюллетень экспериментальной 
биологии и медицины. – 2012. – Т. 15 4. – №9. – С. 330–335. 
[Kaloshin AA, Isakov MA, Mikhailova NA, Vertiev JV. Preparation 
of Recombinant Atoxic Form of Exotoxin A from Pseudomonas 
Aeruginosa. Bull Exp Biol Med. 2013;154(3):346-350.] doi: 10.1007/
s10517-013-1947-1
12. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в 
микробиологических исследованиях. – Л.: Медицинская литература; 1962. 180 с. [Ashmarin IP, Vorob’ev AA. Statisticheskie 
metody v mikrobiologicheskikh issledovaniyakh. Leningrad: Meditsinskaya literatura; 1962. 180 p. (In Russ).]

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Калошин Алексей Алексеевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории протективных 
антигенов ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» 
Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а, тел.: +7 (495) 916-25-87, e-mail: alex-k-1973@yandex.ru 

Леонова Евгения Игоревна, младший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов ФГБУ «НИИ вакцин 
и сывороток им. И.И. Мечникова» 
Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а, тел.: +7 (495) 916-25-87, e-mail: evgeniya-leonova@mail.ru 

Солдатенкова Алёна Владимировна, научный сотрудник лаборатории протективных антигенов ФГБУ «НИИ вакцин 
и сывороток им. И.И. Мечникова» 
Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а, тел.: +7 (495) 916-25-87, e-mail: lesic7@yandex.ru 

Михайлова Наталья Александровна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией протективных 
антигенов, заместитель директора по научной работе ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»
Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а, тел./факс: +7 (495) 917-56-30,
e-mail: n_michailova@inbox.ru