Генетика 

Идентификация локуса, ассоциированного с 
диабетической нефропатией при сахарном 
диабете типа 1 

К.В. Савостьянов'. Д.А. Чистяков'. М.В. Шестакова\ 
О.Е. Воронько', J1.A. Чугунова\ 
М.Ш.Шамхалова
:, 
И.И. Дедов
;, В.В. Носиков' 

' Государственный 
научный 
центр РФ «ГосНИИ 
генетика» 
(дир. — член-корр. 
РАН 
В.Г.Дебабов), 

2 ГУ Эндокринологический 
научный 
центр 
(дир. - акад. РАМН И.И.Дедов) 
РАМН, 
Москва, 

ММ А им. И.М. 
Сеченова 
(ректор 
— акад. РАН и РАМН М.А. 
Пальцев) 

Й

иабетическая 
нефропатия (ДН) относится 
к 
«поздним» 
микрососудистым 
осложнениям 
лиабета, которые развиваются спустя годы по-
оявления основного заболевания. ДН являет­
ся гетерогенной и этиологически 
многофакторной 
ангиопатией. Убедительным указанием на присутст­
вие генетических факторов в развитии ДН явилось 
наблюдение случаев семейного накопления ДН и ее 
сцепленности с другими ангиопатиями, имеющими 
генетические факторы риска [4]. Кроме того, многие 
больные в течение десятилетий переносят возникаю­
щие при диабете метаболические нарушения без раз­
вития Д Н . что в сочетании с популяционными и се­
мейными данными позволяет говорить о наличии 
значительного генетического компонента в патоге­
незе ДН. Вполне правомочным является использова­
ние подхода, основанного на изучении ассоциации 
полиморфных маркеров генома человека с ДН. 

Согласно гемодинамической концепции развития ДН. которая 
наиболее полно объясняет ранние события в станоазении патоло­
гии, важную роль в формировании внутриклубочковой 
гипертен­
зии (ее стойкая форма ведет к структурным изменениям в базаль-
ной мембране эндотелия почечных микрососудов и т.д.) играет ди­
сбаланс в действии сосудосуживающих 
и 
сосудорасширяющих 
агентов. Большое значение в патогенезе нефропатии могут иметь 
гены систем регуляции тонуса сосудов. Прежде всего это ренин — 
ангиотензиновая 
система (РАС), сужающая сосуды, и система 
окиси азота (N0). оказывающая релаксируюшее воздействие. 

Многочисленные ассоциативные исследования в разных по­
пуляциях подтверждают важную роль генов РАС в формирова­
нии предрасположенности к ДН. особенно это касается аллеля D 
и генотипа DD полиморфного маркера 1/D гена фермента, пре­
вращающего ангиотензин I (АСЕ), которые ассоциированы с по­
вышенным риском развития данного осложнения [10]. По всей 
видимости, именно ген АСЕ является наиболее важным генети­
ческим маркером ДН среди генов РАС. поскольку его продукт 
играет ключевую роль в общем и внутрипочечном синтезе сосу­
досуживающего пептида ангиотензина II |6. 8]. Так как генотип 

DD коррелирует с повышенным уровнем 
ангиотензинпревраша-
ющего фермента в плазме, понятна предрасполагающая роль это­

го генотипа на ранних стадиях развития нефропатии (формиро­
вание внутриклубочковой гипертензии под действием высокого 
содержания ангиотензина II в почечных микрососудах) [7]. 

Проведение геномного поиска позволило обнару­
жить в человеческом геноме несколько областей пред­
расположенности к ДН на хромосомах 3, 7, 9. 12 и 20. 
тем самым наглядно подтверждая версию о полиген­
ном характере данной ангиопатии [3]. Однако необхо­
димы дальнейшие исследования по установлению чет­
кой ассоциации этих областей с конкретными генами. 

Сравнение полученных нами данных с публика­
циями других исследователей выявляет значитель­
ную противоречивость результатов. Особенно 
это 
касается 
работ, 
посвяшенных 
ассоциации 
генов 
АСЕ, 
AGT, 
ALR2 
и MTHFR 
с заболеванием [1. 2]. 
Эта противоречивость и была одной из причин то­
го, что в лаборатории Кролевского [9] (США) был 
проведен анализ сцепления с Д Н участков хромо­
сом, содержащих гены АСЕ, 
AGT, 
и AT2R1, 
с ис­
пользованием дискордантных семей из европейской 
популяции США. Анализ показал, что области гено­
ма, содержащие гены АСЕ и AGE, не сцеплены с ДН 
при СД типа 1. но указал на наличие сильного сце­
пления с Д Н участка хромосомы 3 (q21-q25) разме­
ром 20 сМ, содержащей ген AT:R1 
[9]. 

Для изучения ассоциации с ДН области хромосомы 
3, расположенной около гена AT;R1, мы использовали 
группу 
полиморфных 
микросателлитов 
D3S1512, 
D3S2326 и D3S1744 и обследовали 2 группы больных 
СД типа 1 с наличием и отсутствием ДН (табл. 1). 

Объем и методы исследования 

Для идентификации аллелей полиморфных маркеров исполь­
зовали геномную ДНК. выделенную из крови 92 больных СД ти­
па 1 с наличием (п=36) ДН. средний возраст 22.5=4.5 года (со­
отношение м/ж - 18/21) и отсутствием <n=56i ДН. средний воз­
раст 37.9+9.4 года (соотношение м/ж - 28/34). Чтобы снизить 
маскирующее влияние негенетических факторов риска, при фор­
мировании 
групп пациентов 
использовали 
принцип 
крайних 

3/21 

Сахарный диабет 
Генетика 

Таблица 
1 

О б щ а я характеристика групп больных сахарным 

диабетом типа 1 с наличием (ДН+) и отсутствием (ДН-

Параметр 
Д Н + ( п = 3 9 ) Д Н - ( п = 6 2 ) 

Пол, м/ж 
1 8 / 2 1 
2 8 / 3 4 

Возраст, лет 
22.3±4.5 
37.9±9.4 

Возраст начала С Д типа 1, лет 
10.1 ±4.3 
10.4+5.4 

Длительность С Д типа 1, лет 
1 2.2+2.1 
27.5±7.2 

Уровень Н Ь А , % 
11.8±2.2 
11.2±2.6 

Скорость экскреции белка, мг/сут 
1 3 7 1 + 1 1 1 5 
2 6 . U 1 4 . 8 

Систолическое давление, мм рт. ст. 
130.5±21.5 
121.3+14.4 

Диастолическое давление, мм рт. ст. 87.4±17.2 
75.7±8.7 

(«полярных») фенотипов и неперекрывающиеся критерии отбо­
ра. В группу «ДН+» вошли больные с длительностью диабета не 
более 15 лет и ктинической протеинурией (альбуминурия свыше 
300 мг/сут). Группу «ДН-» составили пациенты с альбуминурией 
менее 200 мг/сут. болеющие СД 1 типа на протяжении 20 лет и 
более (см. табл. 1). 

Термостабильная ДНК-полимераза Taq получена от фирмы 
«Ферментас» (Вильнюс. Литва), протеиназа К - 
от фирмы 
«Мегск» (Германия). Синтез использованных в работе олигонук-
леотидных праймеров выполнен ОАО «Синтол» (Москва). Ге­
номную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством 
экстракции фенолом-хлороформом после инкубации с протеина-
зой К в 0.1% растворе SDS [ 111. 

Последовательности праймеров рассчитаны с использовани­
ем программы «Олиго» на основании известных нуктеотидных 
последовательностей. ДНК амплифииировали методом ПЦР на 
термоциктерах РНС-2 («Techne». Великобритания) и «Терцик» 
(Россия) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер 1. 0.2 
ммоль каждого dNTP. по 10 пикомолей каждого из праймеров. 
100-200 нг геномной ДНК и 1.0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Буфер 
1 содержат 67 ммоль Трис-HCl (рН 8.8), 16.6 ммоль сульфата ам­
мония и 0.1% твин-20. Концентрация хлорида магния зависела от 
амлифицируемого локуса. 

На начальной стадии ПЦР денатурировати ДНК при 94°С в 
течение 3 мин. на конечной стадии проводили синтез второй це­
пи при 72°С в течение 7 мин. В промежутке между данными ста­
диями осуществляли 25-35 циклов ПЦР в зависимости от марке­
ра и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, 
включающей денатурацию ДНК (94°С/1 мин), отжиг праймеров 
в течение 1 мин и синтез второй цепи (72°С/1 мин). Условия 
ПЦР и последовательности праймеров для амплификации иссле­
дованных локусов приведены в табл. 2. 

Таблица 2 

Условия ПЦР и последовательности праймеров 

для амплификации полиморфных маркеров 

Полиморфный 

маркер 

Прямой и обратный 

праймеры (5'—>3') 

Буфер 
M g C I 2 

ммоль 

Отжиг, ° C 

D3S1744 

tttaagcggaaggaagtgtg 

ctggccccatctctctctat 

1(+10% 

Д М С О ) 

1.0 
5 5 

D3S2326 

gaattacaggcatgagcca 

acgatagttttggtggctta 

1 (+10% 

Д М С О ) 

2.0 
5 0 

D3S1512 

tcagttcagggagagactc 

ctgtattatatagccctggta 

1 (+10% 

Д М С О ) 

1.0 
5 5 

Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили 
в 12% полиакриламидном геле, который затем окрашивали нит­
ратом серебра [5]. 

Достоверность различий в частотах аллелей и генотипов ис­
следованных маркеров между группами ДН- и ДН+ определяли 
с помощью точного критерия Фишера, на который накладыва-
лась поправка Бонферрони. учитывающая число аллелей и гено­
типов. Достоверными считали различия при р < 0.05. Для оцен­
ки роли генетического маркера (аллеля или генотипа) в развитии 
диабетической нефропатии рассчитывали значения относитель­
ного риска {OR). OR=\ рассматривали как отсутствие ассоциа­
ции, OR > 1 как фактор повышенного риска и OR < 1 как фак­
тор пониженного риска развития патологии. 

Результаты и их обсуждение 

Ген ATjRl 
расположен в области 3q21-q25 в 155.6 
сМ от конца плеча q хромосомы 3, а использован­
ные нами маркеры D3S1512, 
D3S2326 
и D3S1744 
на­
ходятся на расстоянии 
158.4, 159.8 и 161.0 сМ от 
этого же конца, соответственно (см. рисунок). 

В случае маркера D3S1744 
было обнаружено 7 ал­
лелей, включающих от 25 до 31 повтора. Достовер­
ных различий по частотам аллелей между группами 
«ДН+» и «ДН-» не выявлено. Видимо, данный мар­
кер не ассоциирован с Д Н при СД типа 1. 

В случае маркера D3S2326 
было обнаружено 4 ал­
леля, включающих от 24 до 27 повторов. В группе 
пациентов «ДН+» достоверно повышена частота ал­
леля 27 по сравнению с группой больных «ДН-». Ал­
лель 27 обладает наибольшим значением OR (2.96). 
Следовательно, данный аллель можно рассматривать 
как своеобразный маркер повышенного риска разви­
тия Д Н . У больных достоверно снижено содержание 
аллеля 26, характеризующегося минимальным значе­
нием OR (0.42), что формально свидетельствует о его 
предохраняющей 
роли 
по отношению 
к 
раннему 
развитию аутоиммунной патологии. 

D3S1512 

AT.R1 

D3S2326 

D3S1744 

с М 

155.6 
158.4 
159.8 161.0 

Расположение трех полиморфных маркеров хромосомной 

области 3q21 -q25 относительно гена AT.R 1. 

ьотют 
• 
2