Экспериментальная фармакогенетика циклофосфамида: автореферат

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК 

 
ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ 
ФАРМАКОЛОГИИ РАН 
 
 
 
 
На правах рукописи 
 
УДК 615.454.2 
 
ТЕЛЕГИН 
Леонид Юрьевич 
 
 
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОГЕНЕТИКА 
ЦИКЛОФОСФАМИДА 
 
 
(14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология) 
 
 
 
 
 
А в т о р е ф е р а т 
диссертации на соискание учёной степени 
доктора медицинских наук 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

Москва — 2010 
 
 

 

 

 

 

Диссертационная работа выполнена в Учреждении 
Российской 
академии 
наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН 
 
 
 
Научные консультанты: 
 
доктор медицинских наук 
 
 
 
 
 
 
Владимир Митрофанович Писарев 
 
 
 
 
 
 
 
академик РАН, профессор 
 
 
 
 
 
 
Лев Арамович Пирузян 
 
 
Официальные оппоненты: 
 
доктор медицинских наук, профессор 
 
 
 
 
 
 
Владимир Михайлович Бухман 
 
 
 
 
 
 
 
доктор биологических наук, профессор 
 
 
 
 
 
 
Николай Николаевич Золотов 
 
 
 
 
 
 
 
доктор биологических наук 
 
 
 
 
 
 
Виктор Александрович Суханов 
 
Ведущая организация:  
 
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства 
по здравоохранению и социальному развитию" 
 
 
 
Защита диссертации состоится 15 апреля 2011 г. в 11.00 часов на заседании 
диссертационного совета Д.002.252.01 при Учреждении Российской академии 
наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по 
адресу: 119991, Москва, ГСП-1, ул. Косыгина, д. 4. 
 
 
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской 
академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. 
 
 
Автореферат разослан ___ декабря 2010 года 
 
 
Ученый секретарь диссертационного совета, 
доктор медицинских наук 
 
 
 
 
 
И. 
С. 
Николаева

 

 

- 1 
 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 

 

Актуальность проблемы. Тема настоящего исследования тесно переплетается с 

одной из ведущих задач Центра теоретических проблем физико-химической фармаколо
гии РАН – определение метаболического статуса человеческого организма (Л. А. Пиру
зян, 2004) для реализации принципа индивидуализации лекарственной терапии и, в част
ности, иммунодепрессивной терапии. Широкое использование иммунодепрессантов ста
вит перед клиницистами задачу оценить индивидуальную, наследственно обусловленную 

чувствительность (резистентность) к лекарственному воздействию. Очевидно, что для 

решения этой задачи, прежде всего, необходимы целенаправленные экспериментальные 

исследования. 

Вопрос о значении наследственных факторов в определении степени иммуноде
прессии, возникающей под влиянием химиопрепаратов-иммунодепрессантов, ранее сис
тематически исследовался экспериментальной группой лаборатории иммуногенетики 

Института медицинской генетики АМН СССР.  

Всё началось с экспериментального факта, обнаруженного Львом Алексеевичем 

Певницким в процессе работы над докторской диссертацией (Л. А. Певницкий, 1974) – 

наличие межлинейных различий у мышей в степени лекарственно индуцируемой имму
нологической толерантности. Это состояние специфической иммунологической ареак
тивности (неотвечаемости) возникает в результате сочетанного введения в организм экс
периментального животного огромной дозы антигена (тем самым активируется весь им
мунокомпетентный клон) и лекарственного препарата-иммунодепрессанта, приводящего 

к элиминации активированного антигеном клона клеток иммунной системы (так назы
ваемая, клональная форма толерантности, см. Л. Н. Фонталин и Л. А. Певницкий, 1978). 

Данное состояние специфично – сохраняется полноценный иммунный ответ на другие 

антигены. Наилучшие результаты были получены у мышей при использовании в качест
ве антигена эритроцитов барана (ЭБ), в качестве иммунодепрессанта – циклофосфамида 

(ЦФ). Длительность состояния полученной таким образом иммунологической толерант
ности сохранялась до 1 года (почти половина мышиной жизни).  

Нами первоначально был изучен вопрос о существовании подобных межлинейных 

различий у мышей в степени подавления ЦФ первичной иммунной реакции на оптималь
ную иммуногенную дозу ЭБ. В широком диапазоне доз иммунодепрессанта мы выявили 

линии 
мышей, 
контрастно 
реагирующих 
на 
иммунодепрессивное 
воздействие: 

 
- 2 
BALB/cJLacSto (резистентная линия) и DBA/2JSto (чувствительная линия) (Л. А. Пев
ницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Большев, 1977). 

При анализе причин обнаруженных различий мы установили, что иммунологиче
ские механизмы здесь играют подчинённую роль: сопоставление нормальной реакции 

мышей разных генотипов на антиген и степени относительной иммунодепрессии показа
ло, что между этими параметрами связи нет. Так, например, при использовании ЭБ в дозе 

5×108 клеток высота иммунного ответа в контроле была практически одинаковой у мы
шей исследуемых линий, тогда как показатели относительной иммунодепрессии сущест
венно различались. Следует также отметить, что гены комплекса H-2, по-видимому, не 

определяют чувствительность (резистентность) к препарату, поскольку мыши контраст
ных 
генотипов 
BALB/c 
и 
DBA/2 
имеют 
одинаковый 
H-2-гаплотип 
– 
H-2d 

(http://jaxmice.jax.org/strain/000651.html и http://jaxmice.jax.org/strain/000671.html). Причи
ну межлинейных различий при иммунодепрессии и иммунологической толерантности 

следовало 
искать 
в 
особенностях 
поведения 
лекарственного 
препарата
иммунодепрессанта в организме мышей разных генотипов.  

Мы исследовали (Л. Ю. Телегин, 1981) следующие маркёрные признаки фармако
кинетики и фармакодинамики ЦФ в организме мышей разных линий: особенности мета
болизма ЦФ в микросомах клеток печени; фармакокинетику содержания в сыворотке 

крови активных алкилирующих метаболитов ЦФ; иммунодепрессивное действие на тест
клетки ЦФ, активированного in vitro ("активный" постмикросомальный супернатант) и in 

vivo ("активная сыворотка"); чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к 

иммунодепрессивному влиянию "активной сыворотки". 

В результате проведённых исследований было установлено, что для мышей "рези
стентного" генотипа BALB/c по сравнению с мышами "чувствительной" линии DBA/2 

была характерна более высокая скорость метаболизма ЦФ в печени, большее содержание 

активных алкилирующих метаболитов в крови, но меньшая чувствительность иммуно
компетентных клеток-мишеней селезёнки. В процессе проведения опытов был обнару
жен ранее неизвестный факт отсутствия параллелизма между содержанием активных ал
килирующих продуктов метаболизма ЦФ в образцах "активной сыворотки" и её иммуно
депрессивным действием в отношении тест-клеток. Тогда была высказана гипотеза, объ
ясняющая это явление, – усиление интактным ЦФ действия своих активных метаболитов 

– и она нуждалась в экспериментальной проверке. 

Цель и задачи исследований. Настоящее диссертационное исследование является 

логическим продолжением ранее проведённых нами работ. Дальнейшее выяснение меха

 
- 3 
низмов действия и особенностей поведения в организме циклофосфамида, объясняющих 

генетические различия в реакции на этот лекарственный препарат, явилось целью на
стоящей работы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следую
щие задачи: 

1. Выяснить, сохранятся ли подобные соотношения между мышами линий 

BALB/c и DBA/2 при использовании в качестве иммунодепрессантов лекарст
венных препаратов иной структуры и механизма действия (сарколизин, тио
фосфамид, цитозинарабинозид, циклоспорин A). 

2. Исследовать сравнительную чувствительность иммунокомпетентных клеток
мишеней (T- и B-клеток селезёнки) мышей линий BALB/c и DBA/2 к иммуно
депрессивному действию ЦФ in vitro. 

3. Изучить чувствительность лимфоцитов периферической крови человека к дей
ствию ЦФ и тиофосфамида, определить степень изменчивости этого признака, 

выделить разные типы реакции на химиопрепараты (высоко- и низкореаги
рующие индивидуумы) и исследовать возможные механизмы различий в чув
ствительности к иммунодепрессантам. 

4. Изучить особенности острого токсического действия ЦФ у мышей BALB/c и 

DBA/2, обладающих контрастной чувствительностью к иммунодепрессивному 

действию ЦФ (активность некоторых ферментов метаболизма ЦФ, кинетика 

токсического метаболита ЦФ, акролеина, кинетические показатели содержания 

свободных сульфгидрильных групп). 

5. Определить уровень репликативного и репаративного синтеза ДНК в сплено
цитах интактных мышей BALB/c и DBA/2 как возможного фактора, опреде
ляющего разную чувствительность клеток-мишеней мышей данных генотипов 

к действию ЦФ. 

6. В разных экспериментальных условиях подробно исследовать ранее не уста
новленный механизм биологического действия ЦФ, проверив выдвинутую ра
нее нами гипотезу (Л. Ю. Телегин, 1981) об усилении нативным ЦФ действия 

собственных активных метаболитов. 

Положения, выносимые на защиту: 

1. Разработан фармакогенетический подход для выяснения причин разной чувст
вительности к действию циклофосфамида. 

2. Мыши двух линий, для которых характерна неодинаковая чувствительность к 

иммунодепрессивному действию циклофосфамида in vivo (BALB/cJLacSto – 

 
- 4 
низкая, DBA/2JSto – высокая), имеют такой же тип чувствительности in vivo и 

к другим иммунодепрессантам – сарколизину, тиофосфамиду, цитозинараби
нозиду и циклоспорину A. 

3. Клетки селезёнки мышей линии BALB/cJLacSto обладают более высокой рези
стентностью к действию циклофосфамида, сарколизина, тиофосфамида и цито
зинарабинозида, чем клетки селезёнки мышей линии DBA/2JSto. Таким обра
зом, наблюдается прямая корреляция между степенью чувствительности мы
шей этих линий к иммунодепрессантам in vivo и степенью подавления иммун
ной реакции их иммунокомпетентных клеток in vitro. 

4. T- и B-клетки селезёнки мышей "резистентной" к циклофосфамиду линии 

BALB/cJLacSto более устойчивы к иммунодепрессивному действию цикло
фосфамида in vitro, чем T- и B-клетки селезёнки мышей "чувствительной" к 

этому иммунодепрессанту линии DBA/2JSto. У мышей обеих линий T
лимфоциты поражаются циклофосфамидом сильнее, чем B-клетки. 

5. Существует выраженная фенотипическая изменчивость чувствительности 

лимфоцитов периферической крови человека к подавлению антипролифера
тивного потенциала с помощью циклофосфамида и тиофосфамида. Выделены 

контрастные и промежуточные типы реагирования на данные алкилирующие 

агенты. Как и в опытах на животных, тип чувствительности клеток сохраняется 

независимо от вида применённого алкилирующего агента. 

6. Признак "тип чувствительности" к действию циклофосфамида и тиофосфамида 

характеризуется относительным постоянством и не зависит от величины пока
зателя "индекс стимуляции". Отсутствует ассоциация данного признака с фе
нотипом HLA-A-B-C лимфоцитов.  

7. Причина разной чувствительности лимфоцитов периферической крови челове
ка может быть связана с неодинаковой способностью цитозолей лимфоцитов 

инактивировать исследуемые алкилирующие агенты, что, в свою очередь, мо
жет быть обусловлено внутриклеточным балансом тиоловых соединений. 

8. Имеются контрастные межлинейные различия у мышей в чувствительности к 

токсическому действию циклофосфамида при однократном внутрибрюшинном 

введении циклофосфамида в дозе 350 мг/кг. В печени, крови и селезёнки "вы
сокочувствительных" к токсическому действию циклофосфамида мышей 

DBA/2JSto обнаружены изменения следующих показателей, отличающиеся от 

таковых мышей BALB/cJLacSto: более низкая активность в печени изоформы 

 
- 5 
цитохрома P450, ответственной за активацию циклофосфамида; более низкое 

содержание в печени интактных мышей SH-групп; бóльшая площадь под кри
вой содержания в печени токсического метаболита циклофосфамида – акро
леина; более высокое содержание алкогольдегидрогеназы в крови – маркёра 

центрилобулярного повреждения печени; в крови выявлено более низкое со
держание акролеина, а также было более низким содержание SH-групп; в селе
зёнке – уровень SH-групп был ниже, а содержание акролеина – выше, чем у 

BALB/cJLacSto. 

9. В спленоцитах интактных мышей DBA/2JSto по сравнению с мышами 

BALB/cJLacSto отмечается более низкий уровень репликативного и репаратив
ного синтеза ДНК. 

10. В трёх экспериментальных системах удалось доказать наличие нового меха
низма действия циклофосфамида: интактный препарат, неактивный per se, уси
ливает иммунодепрессивное, антипролиферативное и мутагенное действие 

своих собственных активных метаболитов.  

Научная новизна работы. Использование фармакогенетического подхода позво
лило впервые выявить генетически контролируемые факторы, их роль и значение в опре
делении степени чувствительности (устойчивости) к действию циклофосфамида. Впер
вые было показано, что высокая степень чувствительности к действию циклофосфамида 

определяется сочетанием низкой активности систем активации и инактивации препарата 

в процессе метаболизма, что обеспечивает феномен усиления циклофосфамидом биоло
гического действия собственных активных метаболитов; низкого содержания свободных 

сульфгидрильных групп в клетках-мишенях и низкой активностью в них систем репара
ции повреждений ДНК. Фенотип устойчивости к действию ЦФ in vivo определяется 

максимальным значением этих показателей. Впервые обнаружено явление усиления цик
лофосфамидом действия своих собственных активных метаболитов, и существование 

этого феномена была доказано при исследовании иммунодепрессивного, антипролифера
тивного и мутагенного действия циклофосфамида. 

Практическая ценность работы. Проведённые исследования вносят вклад в по
нимание механизмов действия циклофосфамида, открывая новые возможности при раз
работке наиболее эффективных способов подавления пролиферативной реакции клеток 

при их экстракорпоральной обработке (получен патент РФ № 2393481, зарегистрировано 

в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июня 2010 г.). Полу
ченные сведения о конкретизации механизмов, с помощью которых реализуются генети

 
- 6 
ческие различия в действии иммунодепрессивных и противораковых препаратов, могут 

быть применены при разработке подходов к персонифицированной медицине, главный 

принцип которой – "лечить не болезнь, а больного" – был сформулирован знаменитым 

русским терапевтом Михаилом Яковлевичем Мудровым ещё в 1820 г. в книге "Слово о 

способе учить и учиться медицине практической": "Я намерен сообщить вам новую ис
тину, которой многие не поверят и которую, может быть, не все из вас постигнут. Враче
вание не состоит в лечении болезни... Врачевание состоит в лечении самого больного.… 

Каждый больной, по различию сложения своего, требует особого лечения, хотя болезнь 

одна и та же" (цит. по А. Л. Мясников, 1951). 

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзной конфе
ренции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989 г.; Всесоюзной кон
ференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и 

подходы", Москва, 1989 г.; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки", 

Минск, 1991 г.; I Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992 г.; I Съезде Вавилов
ского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов, 20-25 декабря 1994 г.; 

Межлабораторной конференции ЦТП ФХФ РАН, 8 сентября 2010 г., Конференции лабо
ратории биофизической биохимии Гематологического научного центра РАМН, 

11октября 2010 г. 

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ. 

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из "Введения", главы 1 

"Обзор литературы", раздела "Экспериментальная часть", который содержит главы "Ма
териалы и методы", "Результаты опытов", "Обсуждение экспериментальных данных", 

глав "Заключение", "Выводы" и списка цитируемой литературы. Работа содержит 155 

страниц машинописного текста, 21 таблицу и 26 рисунков. Список литературы включает 

247 источников, из них 42 – на русском языке. 

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 

Животные. 
В 
опытах 
использовали 
мышей-самцов 
инбредных 
линий 

BALB/cJLacSto (BALB/c), CBA/CaLacY (CBA) и DBA/2JSto (DBA/2), гибридов 

(BALB/cJLacSto ×DBA/2JSto)F1 (CD2F1, собственное выведение в виварии Института ме
дицинской генетики АМН СССР) и самок линии C57BL/6J (обозначения линий приведе
ны согласно Международной стандартной номенклатуре, Staats, 1985). Мыши получали 

стандартный пищевой рацион вивария и имели свободный доступ к питьевой воде. Для 

 
- 7 
получение анти-T-сыворотки и анти-B-клеточного глобулина использовали кроликов по
роды "Советская шиншилла", которых получали из питомника АМН СССР "Светлые го
ры". 

Антиген. В качестве антигена применяли эритроциты барана (ЭБ), взятые сте
рильно в консервант № 7Б и хранившиеся при 4 oC. Перед иммунизацией эритроциты 

трижды отмывали стерильным 0,9 % раствором хлорида натрия или стерильным солевым 

раствором, забуференном фосфатами (PBS), pH 7,4. В опытах по исследованию иммуно
депрессии первичного иммунного ответа ЭБ вводили мышам внутривенно в дозе 5×108 

клеток в объёме 0,2 мл. В опытах с адоптивным переносом доза ЭБ составляла 4×108 кле
ток; их вводили либо вместе с клетками селезёнки внутривенно (суммарный объём 1 мл), 

либо отдельно внутрибрюшинно (0,4 мл). 

Иммунодепрессанты. В качестве иммунодепрессантов в работе использовали 

циклофосфамид (ЦФ, отечественный препарат "Циклофосфан", производство ОАО 

"Биохимик", Саранск, Россия), мафосфамид (МАФ, циклогексиламиновая соль, D-17272, 

любезно предоставлен профессором Norbert Brock и доктором Jörg Pohl, фирма Asta 

Medica, Германия), сарколизин (СЛ, синтезирован в химико-технологической лаборато
рии Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР, любезно предоставлен 

к. б. н. Т. А. Сидоровой), тиофосфамид (ТиоТЭФ, синтезирован во Всесоюзном научно
исследовательском химико-фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе, любезно 

предоставлен проф. Л. Н. Филитисом), цитозинарабинозид (ЦА, препарат "Cytosar", 

фирма Upjohn, Бельгия), циклоспорин A (ЦсА, препарат "Sandimmun", Novartis, Швей
цария). Все препараты (кроме мафосфамида, который использовали только в экспери
ментах in vitro) вводили животным внутрибрюшинно, по весу, растворёнными в дистил
лированной воде или стерильном физиологическом растворе. 

Метод определения антителообразующих клеток (АОК) в селезёнке мышей. 

Высоту первичного иммунного ответа оценивали на 4 или 5 сутки после иммунизации в 

зависимости от условий опыта. Число АОК в селезёнке животных определяли при помо
щи "прямого" метода локального гемолиза в геле (Jerne & Nordin, 1963). Методика по
становки реакции детально описана в работах отечественных авторов (Л. А. Певницкий и 

соавт., 1965; В. М. Писарев, 1980; Л. Ю. Телегин, 1981). 

Методика активации циклофосфамида in vivo. Так как в отличие от других ал
килирующих агентов ЦФ in vitro не обладает биологической активностью в нативном со
стоянии, то в опытах по изучению его действия на клетки in vitro, помимо МАФ, исполь
зовали "активированную" форму ЦФ, т. е. активные метаболиты, содержащиеся в сыво

 
- 8 
ротке крови животных, которым вводили ЦФ (Л. Ю. Телегин, 1979). С этой целью мы
шам линии BALB/c инъецировали внутрибрюшинно 200 мг/кг ЦФ, через 30 мин их заби
вали и получали так называемую "активную сыворотку", которую использовали в день 

постановки опыта. В опытах по изучению чувствительности лимфоцитов человека к дей
ствию ЦФ полученную "активную сыворотку" подвергали стерилизующей фильтрации и 

хранили не более 3 дней до начала опыта согласно рекомендациям Weaver и соавт. 

(1978). Содержание алкилирующих метаболитов в образцах "активной сыворотки" опре
деляли с помощью NBP-теста, предложенного Epstein с соавт. (1955) и основанного на 

взаимодействии 4-(п-нитробензил)пиридина (NBP) с алкилирующими группами при тем
пературе 80-100 ˚C. Использовали модификацию (О. П. Кириченко и др., 1976) методики, 

описанной Friedman & Boger (1962). Результаты выражали в единицах оптической плот
ности на мл пробы. 

Методы исследования действия иммунодепрессантов in vitro. Действие на об
щую популяцию клеток селезёнки мышей. Из селезёнок мышей готовили клеточную 

взвесь в среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия) с 

антибиотиками (по 100 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл). Взвесь инкубировали 

с исследуемыми агентами – "активной сывороткой", СЛ, ТиоТЭФ или МАФ в течение 1 

часа при 37 ˚C. В 1 мл инкубационной смеси содержалось 1,25×108 клеток селезёнки и 

соответствующее количество иммунодепрессанта: 0,5 мл "активной сыворотки", 6 мкг 

СЛ, 12,5 мкг ТиоТЭФ или 1,5 мкг МАФ. Эти концентрации иммунодепрессантов (кроме 

МАФ) были подобраны эмпирически с целью получения одинаковой степени подавления 

иммунной реакции клеток мышей одной линии (BALB/c). Концентрация МАФ подавляла 

на 50 % иммунный ответ спленоцитов мышей линии CBA, поэтому и была использована 

для сравнительного анализа. После инкубации клетки отмывали однократно охлаждён
ной до 4 ˚C средой 199 и вводили внутривенной сингенным мышам-реципиентам в коли
честве 5×107 вместе с ЭБ. Реципиенты за 3-4 часа до введения клеток получали внутри
брюшинно 200 мг/кг ЦФ для подавления их собственной иммунореактивности. Такая об
работка мышей-реципиентов эквивалентна сублетальному облучению и обеспечивает их 

иммунологическую ареактивность до 6 дней, что позволяет в течение этого срока оцени
вать иммунный ответ донорских клеток, обработанных различными агентами (Г. К. Бай
муканова, Н. Н. Смирнова, 1977). Через 5 дней после переноса определяли число АОК в 

селезёнке реципиентов. 

Действие на T- и B-клетки. В опытах по изучению влияния "активированного" 

ЦФ на субпопуляции клеток селезёнки (T- и B-лимфоциты) была использована методика,