УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК 

 
ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ 
ФАРМАКОЛОГИИ РАН 
 
 
 
 
На правах рукописи 
 
УДК 615.454.2 
 
ТЕЛЕГИН 
Леонид Юрьевич 
 
 
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОГЕНЕТИКА 
ЦИКЛОФОСФАМИДА 
 
 
(14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология) 
 
 
 
 
 
А в т о р е ф е р а т 
диссертации на соискание учёной степени 
доктора медицинских наук 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

Москва — 2010 
 
 

 

 

 

 

Диссертационная работа выполнена в Учреждении 
Российской 
академии 
наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН 
 
 
 
Научные консультанты: 
 
доктор медицинских наук 
 
 
 
 
 
 
Владимир Митрофанович Писарев 
 
 
 
 
 
 
 
академик РАН, профессор 
 
 
 
 
 
 
Лев Арамович Пирузян 
 
 
Официальные оппоненты: 
 
доктор медицинских наук, профессор 
 
 
 
 
 
 
Владимир Михайлович Бухман 
 
 
 
 
 
 
 
доктор биологических наук, профессор 
 
 
 
 
 
 
Николай Николаевич Золотов 
 
 
 
 
 
 
 
доктор биологических наук 
 
 
 
 
 
 
Виктор Александрович Суханов 
 
Ведущая организация:  
 
Государственное образовательное учреж-
дение высшего профессионального образования "Московский государст-
венный медико-стоматологический университет Федерального агентства 
по здравоохранению и социальному развитию" 
 
 
 
Защита диссертации состоится 15 апреля 2011 г. в 11.00 часов на заседании 
диссертационного совета Д.002.252.01 при Учреждении Российской академии 
наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по 
адресу: 119991, Москва, ГСП-1, ул. Косыгина, д. 4. 
 
 
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской 
академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармаколо-
гии РАН. 
 
 
Автореферат разослан ___ декабря 2010 года 
 
 
Ученый секретарь диссертационного совета, 
доктор медицинских наук 
 
 
 
 
 
И. 
С. 
Николаева

 

 

- 1 -

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 

 

Актуальность проблемы. Тема настоящего исследования тесно переплетается с 

одной из ведущих задач Центра теоретических проблем физико-химической фармаколо-

гии РАН – определение метаболического статуса человеческого организма (Л. А. Пиру-

зян, 2004) для реализации принципа индивидуализации лекарственной терапии и, в част-

ности, иммунодепрессивной терапии. Широкое использование иммунодепрессантов ста-

вит перед клиницистами задачу оценить индивидуальную, наследственно обусловленную 

чувствительность (резистентность) к лекарственному воздействию. Очевидно, что для 

решения этой задачи, прежде всего, необходимы целенаправленные экспериментальные 

исследования. 

Вопрос о значении наследственных факторов в определении степени иммуноде-

прессии, возникающей под влиянием химиопрепаратов-иммунодепрессантов, ранее сис-

тематически исследовался экспериментальной группой лаборатории иммуногенетики 

Института медицинской генетики АМН СССР.  

Всё началось с экспериментального факта, обнаруженного Львом Алексеевичем 

Певницким в процессе работы над докторской диссертацией (Л. А. Певницкий, 1974) – 

наличие межлинейных различий у мышей в степени лекарственно индуцируемой имму-

нологической толерантности. Это состояние специфической иммунологической ареак-

тивности (неотвечаемости) возникает в результате сочетанного введения в организм экс-

периментального животного огромной дозы антигена (тем самым активируется весь им-

мунокомпетентный клон) и лекарственного препарата-иммунодепрессанта, приводящего 

к элиминации активированного антигеном клона клеток иммунной системы (так назы-

ваемая, клональная форма толерантности, см. Л. Н. Фонталин и Л. А. Певницкий, 1978). 

Данное состояние специфично – сохраняется полноценный иммунный ответ на другие 

антигены. Наилучшие результаты были получены у мышей при использовании в качест-

ве антигена эритроцитов барана (ЭБ), в качестве иммунодепрессанта – циклофосфамида 

(ЦФ). Длительность состояния полученной таким образом иммунологической толерант-

ности сохранялась до 1 года (почти половина мышиной жизни).  

Нами первоначально был изучен вопрос о существовании подобных межлинейных 

различий у мышей в степени подавления ЦФ первичной иммунной реакции на оптималь-

ную иммуногенную дозу ЭБ. В широком диапазоне доз иммунодепрессанта мы выявили 

линии 
мышей, 
контрастно 
реагирующих 
на 
иммунодепрессивное 
воздействие: 

 
- 2 -

BALB/cJLacSto (резистентная линия) и DBA/2JSto (чувствительная линия) (Л. А. Пев-

ницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Большев, 1977). 

При анализе причин обнаруженных различий мы установили, что иммунологиче-

ские механизмы здесь играют подчинённую роль: сопоставление нормальной реакции 

мышей разных генотипов на антиген и степени относительной иммунодепрессии показа-

ло, что между этими параметрами связи нет. Так, например, при использовании ЭБ в дозе 

5×108 клеток высота иммунного ответа в контроле была практически одинаковой у мы-

шей исследуемых линий, тогда как показатели относительной иммунодепрессии сущест-

венно различались. Следует также отметить, что гены комплекса H-2, по-видимому, не 

определяют чувствительность (резистентность) к препарату, поскольку мыши контраст-

ных 
генотипов 
BALB/c 
и 
DBA/2 
имеют 
одинаковый 
H-2-гаплотип 
– 
H-2d 

(http://jaxmice.jax.org/strain/000651.html и http://jaxmice.jax.org/strain/000671.html). Причи-

ну межлинейных различий при иммунодепрессии и иммунологической толерантности 

следовало 
искать 
в 
особенностях 
поведения 
лекарственного 
препарата-

иммунодепрессанта в организме мышей разных генотипов.  

Мы исследовали (Л. Ю. Телегин, 1981) следующие маркёрные признаки фармако-

кинетики и фармакодинамики ЦФ в организме мышей разных линий: особенности мета-

болизма ЦФ в микросомах клеток печени; фармакокинетику содержания в сыворотке 

крови активных алкилирующих метаболитов ЦФ; иммунодепрессивное действие на тест-

клетки ЦФ, активированного in vitro ("активный" постмикросомальный супернатант) и in 

vivo ("активная сыворотка"); чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к 

иммунодепрессивному влиянию "активной сыворотки". 

В результате проведённых исследований было установлено, что для мышей "рези-

стентного" генотипа BALB/c по сравнению с мышами "чувствительной" линии DBA/2 

была характерна более высокая скорость метаболизма ЦФ в печени, большее содержание 

активных алкилирующих метаболитов в крови, но меньшая чувствительность иммуно-

компетентных клеток-мишеней селезёнки. В процессе проведения опытов был обнару-

жен ранее неизвестный факт отсутствия параллелизма между содержанием активных ал-

килирующих продуктов метаболизма ЦФ в образцах "активной сыворотки" и её иммуно-

депрессивным действием в отношении тест-клеток. Тогда была высказана гипотеза, объ-

ясняющая это явление, – усиление интактным ЦФ действия своих активных метаболитов 

– и она нуждалась в экспериментальной проверке. 

Цель и задачи исследований. Настоящее диссертационное исследование является 

логическим продолжением ранее проведённых нами работ. Дальнейшее выяснение меха-

 
- 3 -

низмов действия и особенностей поведения в организме циклофосфамида, объясняющих 

генетические различия в реакции на этот лекарственный препарат, явилось целью на-

стоящей работы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следую-

щие задачи: 

1. Выяснить, сохранятся ли подобные соотношения между мышами линий 

BALB/c и DBA/2 при использовании в качестве иммунодепрессантов лекарст-

венных препаратов иной структуры и механизма действия (сарколизин, тио-

фосфамид, цитозинарабинозид, циклоспорин A). 

2. Исследовать сравнительную чувствительность иммунокомпетентных клеток-

мишеней (T- и B-клеток селезёнки) мышей линий BALB/c и DBA/2 к иммуно-

депрессивному действию ЦФ in vitro. 

3. Изучить чувствительность лимфоцитов периферической крови человека к дей-

ствию ЦФ и тиофосфамида, определить степень изменчивости этого признака, 

выделить разные типы реакции на химиопрепараты (высоко- и низкореаги-

рующие индивидуумы) и исследовать возможные механизмы различий в чув-

ствительности к иммунодепрессантам. 

4. Изучить особенности острого токсического действия ЦФ у мышей BALB/c и 

DBA/2, обладающих контрастной чувствительностью к иммунодепрессивному 

действию ЦФ (активность некоторых ферментов метаболизма ЦФ, кинетика 

токсического метаболита ЦФ, акролеина, кинетические показатели содержания 

свободных сульфгидрильных групп). 

5. Определить уровень репликативного и репаративного синтеза ДНК в сплено-

цитах интактных мышей BALB/c и DBA/2 как возможного фактора, опреде-

ляющего разную чувствительность клеток-мишеней мышей данных генотипов 

к действию ЦФ. 

6. В разных экспериментальных условиях подробно исследовать ранее не уста-

новленный механизм биологического действия ЦФ, проверив выдвинутую ра-

нее нами гипотезу (Л. Ю. Телегин, 1981) об усилении нативным ЦФ действия 

собственных активных метаболитов. 

Положения, выносимые на защиту: 

1. Разработан фармакогенетический подход для выяснения причин разной чувст-

вительности к действию циклофосфамида. 

2. Мыши двух линий, для которых характерна неодинаковая чувствительность к 

иммунодепрессивному действию циклофосфамида in vivo (BALB/cJLacSto – 

 
- 4 -

низкая, DBA/2JSto – высокая), имеют такой же тип чувствительности in vivo и 

к другим иммунодепрессантам – сарколизину, тиофосфамиду, цитозинараби-

нозиду и циклоспорину A. 

3. Клетки селезёнки мышей линии BALB/cJLacSto обладают более высокой рези-

стентностью к действию циклофосфамида, сарколизина, тиофосфамида и цито-

зинарабинозида, чем клетки селезёнки мышей линии DBA/2JSto. Таким обра-

зом, наблюдается прямая корреляция между степенью чувствительности мы-

шей этих линий к иммунодепрессантам in vivo и степенью подавления иммун-

ной реакции их иммунокомпетентных клеток in vitro. 

4. T- и B-клетки селезёнки мышей "резистентной" к циклофосфамиду линии 

BALB/cJLacSto более устойчивы к иммунодепрессивному действию цикло-

фосфамида in vitro, чем T- и B-клетки селезёнки мышей "чувствительной" к 

этому иммунодепрессанту линии DBA/2JSto. У мышей обеих линий T-

лимфоциты поражаются циклофосфамидом сильнее, чем B-клетки. 

5. Существует выраженная фенотипическая изменчивость чувствительности 

лимфоцитов периферической крови человека к подавлению антипролифера-

тивного потенциала с помощью циклофосфамида и тиофосфамида. Выделены 

контрастные и промежуточные типы реагирования на данные алкилирующие 

агенты. Как и в опытах на животных, тип чувствительности клеток сохраняется 

независимо от вида применённого алкилирующего агента. 

6. Признак "тип чувствительности" к действию циклофосфамида и тиофосфамида 

характеризуется относительным постоянством и не зависит от величины пока-

зателя "индекс стимуляции". Отсутствует ассоциация данного признака с фе-

нотипом HLA-A-B-C лимфоцитов.  

7. Причина разной чувствительности лимфоцитов периферической крови челове-

ка может быть связана с неодинаковой способностью цитозолей лимфоцитов 

инактивировать исследуемые алкилирующие агенты, что, в свою очередь, мо-

жет быть обусловлено внутриклеточным балансом тиоловых соединений. 

8. Имеются контрастные межлинейные различия у мышей в чувствительности к 

токсическому действию циклофосфамида при однократном внутрибрюшинном 

введении циклофосфамида в дозе 350 мг/кг. В печени, крови и селезёнки "вы-

сокочувствительных" к токсическому действию циклофосфамида мышей 

DBA/2JSto обнаружены изменения следующих показателей, отличающиеся от 

таковых мышей BALB/cJLacSto: более низкая активность в печени изоформы 

 
- 5 -

цитохрома P450, ответственной за активацию циклофосфамида; более низкое 

содержание в печени интактных мышей SH-групп; бóльшая площадь под кри-

вой содержания в печени токсического метаболита циклофосфамида – акро-

леина; более высокое содержание алкогольдегидрогеназы в крови – маркёра 

центрилобулярного повреждения печени; в крови выявлено более низкое со-

держание акролеина, а также было более низким содержание SH-групп; в селе-

зёнке – уровень SH-групп был ниже, а содержание акролеина – выше, чем у 

BALB/cJLacSto. 

9. В спленоцитах интактных мышей DBA/2JSto по сравнению с мышами 

BALB/cJLacSto отмечается более низкий уровень репликативного и репаратив-

ного синтеза ДНК. 

10. В трёх экспериментальных системах удалось доказать наличие нового меха-

низма действия циклофосфамида: интактный препарат, неактивный per se, уси-

ливает иммунодепрессивное, антипролиферативное и мутагенное действие 

своих собственных активных метаболитов.  

Научная новизна работы. Использование фармакогенетического подхода позво-

лило впервые выявить генетически контролируемые факторы, их роль и значение в опре-

делении степени чувствительности (устойчивости) к действию циклофосфамида. Впер-

вые было показано, что высокая степень чувствительности к действию циклофосфамида 

определяется сочетанием низкой активности систем активации и инактивации препарата 

в процессе метаболизма, что обеспечивает феномен усиления циклофосфамидом биоло-

гического действия собственных активных метаболитов; низкого содержания свободных 

сульфгидрильных групп в клетках-мишенях и низкой активностью в них систем репара-

ции повреждений ДНК. Фенотип устойчивости к действию ЦФ in vivo определяется 

максимальным значением этих показателей. Впервые обнаружено явление усиления цик-

лофосфамидом действия своих собственных активных метаболитов, и существование 

этого феномена была доказано при исследовании иммунодепрессивного, антипролифера-

тивного и мутагенного действия циклофосфамида. 

Практическая ценность работы. Проведённые исследования вносят вклад в по-

нимание механизмов действия циклофосфамида, открывая новые возможности при раз-

работке наиболее эффективных способов подавления пролиферативной реакции клеток 

при их экстракорпоральной обработке (получен патент РФ № 2393481, зарегистрировано 

в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июня 2010 г.). Полу-

ченные сведения о конкретизации механизмов, с помощью которых реализуются генети-

 
- 6 -

ческие различия в действии иммунодепрессивных и противораковых препаратов, могут 

быть применены при разработке подходов к персонифицированной медицине, главный 

принцип которой – "лечить не болезнь, а больного" – был сформулирован знаменитым 

русским терапевтом Михаилом Яковлевичем Мудровым ещё в 1820 г. в книге "Слово о 

способе учить и учиться медицине практической": "Я намерен сообщить вам новую ис-

тину, которой многие не поверят и которую, может быть, не все из вас постигнут. Враче-

вание не состоит в лечении болезни... Врачевание состоит в лечении самого больного.… 

Каждый больной, по различию сложения своего, требует особого лечения, хотя болезнь 

одна и та же" (цит. по А. Л. Мясников, 1951). 

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзной конфе-

ренции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989 г.; Всесоюзной кон-

ференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и 

подходы", Москва, 1989 г.; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки", 

Минск, 1991 г.; I Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992 г.; I Съезде Вавилов-

ского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов, 20-25 декабря 1994 г.; 

Межлабораторной конференции ЦТП ФХФ РАН, 8 сентября 2010 г., Конференции лабо-

ратории биофизической биохимии Гематологического научного центра РАМН, 

11октября 2010 г. 

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ. 

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из "Введения", главы 1 

"Обзор литературы", раздела "Экспериментальная часть", который содержит главы "Ма-

териалы и методы", "Результаты опытов", "Обсуждение экспериментальных данных", 

глав "Заключение", "Выводы" и списка цитируемой литературы. Работа содержит 155 

страниц машинописного текста, 21 таблицу и 26 рисунков. Список литературы включает 

247 источников, из них 42 – на русском языке. 

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 

Животные. 
В 
опытах 
использовали 
мышей-самцов 
инбредных 
линий 

BALB/cJLacSto (BALB/c), CBA/CaLacY (CBA) и DBA/2JSto (DBA/2), гибридов 

(BALB/cJLacSto ×DBA/2JSto)F1 (CD2F1, собственное выведение в виварии Института ме-

дицинской генетики АМН СССР) и самок линии C57BL/6J (обозначения линий приведе-

ны согласно Международной стандартной номенклатуре, Staats, 1985). Мыши получали 

стандартный пищевой рацион вивария и имели свободный доступ к питьевой воде. Для 

 
- 7 -

получение анти-T-сыворотки и анти-B-клеточного глобулина использовали кроликов по-

роды "Советская шиншилла", которых получали из питомника АМН СССР "Светлые го-

ры". 

Антиген. В качестве антигена применяли эритроциты барана (ЭБ), взятые сте-

рильно в консервант № 7Б и хранившиеся при 4 oC. Перед иммунизацией эритроциты 

трижды отмывали стерильным 0,9 % раствором хлорида натрия или стерильным солевым 

раствором, забуференном фосфатами (PBS), pH 7,4. В опытах по исследованию иммуно-

депрессии первичного иммунного ответа ЭБ вводили мышам внутривенно в дозе 5×108 

клеток в объёме 0,2 мл. В опытах с адоптивным переносом доза ЭБ составляла 4×108 кле-

ток; их вводили либо вместе с клетками селезёнки внутривенно (суммарный объём 1 мл), 

либо отдельно внутрибрюшинно (0,4 мл). 

Иммунодепрессанты. В качестве иммунодепрессантов в работе использовали 

циклофосфамид (ЦФ, отечественный препарат "Циклофосфан", производство ОАО 

"Биохимик", Саранск, Россия), мафосфамид (МАФ, циклогексиламиновая соль, D-17272, 

любезно предоставлен профессором Norbert Brock и доктором Jörg Pohl, фирма Asta 

Medica, Германия), сарколизин (СЛ, синтезирован в химико-технологической лаборато-

рии Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР, любезно предоставлен 

к. б. н. Т. А. Сидоровой), тиофосфамид (ТиоТЭФ, синтезирован во Всесоюзном научно-

исследовательском химико-фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе, любезно 

предоставлен проф. Л. Н. Филитисом), цитозинарабинозид (ЦА, препарат "Cytosar", 

фирма Upjohn, Бельгия), циклоспорин A (ЦсА, препарат "Sandimmun", Novartis, Швей-

цария). Все препараты (кроме мафосфамида, который использовали только в экспери-

ментах in vitro) вводили животным внутрибрюшинно, по весу, растворёнными в дистил-

лированной воде или стерильном физиологическом растворе. 

Метод определения антителообразующих клеток (АОК) в селезёнке мышей. 

Высоту первичного иммунного ответа оценивали на 4 или 5 сутки после иммунизации в 

зависимости от условий опыта. Число АОК в селезёнке животных определяли при помо-

щи "прямого" метода локального гемолиза в геле (Jerne & Nordin, 1963). Методика по-

становки реакции детально описана в работах отечественных авторов (Л. А. Певницкий и 

соавт., 1965; В. М. Писарев, 1980; Л. Ю. Телегин, 1981). 

Методика активации циклофосфамида in vivo. Так как в отличие от других ал-

килирующих агентов ЦФ in vitro не обладает биологической активностью в нативном со-

стоянии, то в опытах по изучению его действия на клетки in vitro, помимо МАФ, исполь-

зовали "активированную" форму ЦФ, т. е. активные метаболиты, содержащиеся в сыво-

 
- 8 -

ротке крови животных, которым вводили ЦФ (Л. Ю. Телегин, 1979). С этой целью мы-

шам линии BALB/c инъецировали внутрибрюшинно 200 мг/кг ЦФ, через 30 мин их заби-

вали и получали так называемую "активную сыворотку", которую использовали в день 

постановки опыта. В опытах по изучению чувствительности лимфоцитов человека к дей-

ствию ЦФ полученную "активную сыворотку" подвергали стерилизующей фильтрации и 

хранили не более 3 дней до начала опыта согласно рекомендациям Weaver и соавт. 

(1978). Содержание алкилирующих метаболитов в образцах "активной сыворотки" опре-

деляли с помощью NBP-теста, предложенного Epstein с соавт. (1955) и основанного на 

взаимодействии 4-(п-нитробензил)пиридина (NBP) с алкилирующими группами при тем-

пературе 80-100 ˚C. Использовали модификацию (О. П. Кириченко и др., 1976) методики, 

описанной Friedman & Boger (1962). Результаты выражали в единицах оптической плот-

ности на мл пробы. 

Методы исследования действия иммунодепрессантов in vitro. Действие на об-

щую популяцию клеток селезёнки мышей. Из селезёнок мышей готовили клеточную 

взвесь в среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия) с 

антибиотиками (по 100 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл). Взвесь инкубировали 

с исследуемыми агентами – "активной сывороткой", СЛ, ТиоТЭФ или МАФ в течение 1 

часа при 37 ˚C. В 1 мл инкубационной смеси содержалось 1,25×108 клеток селезёнки и 

соответствующее количество иммунодепрессанта: 0,5 мл "активной сыворотки", 6 мкг 

СЛ, 12,5 мкг ТиоТЭФ или 1,5 мкг МАФ. Эти концентрации иммунодепрессантов (кроме 

МАФ) были подобраны эмпирически с целью получения одинаковой степени подавления 

иммунной реакции клеток мышей одной линии (BALB/c). Концентрация МАФ подавляла 

на 50 % иммунный ответ спленоцитов мышей линии CBA, поэтому и была использована 

для сравнительного анализа. После инкубации клетки отмывали однократно охлаждён-

ной до 4 ˚C средой 199 и вводили внутривенной сингенным мышам-реципиентам в коли-

честве 5×107 вместе с ЭБ. Реципиенты за 3-4 часа до введения клеток получали внутри-

брюшинно 200 мг/кг ЦФ для подавления их собственной иммунореактивности. Такая об-

работка мышей-реципиентов эквивалентна сублетальному облучению и обеспечивает их 

иммунологическую ареактивность до 6 дней, что позволяет в течение этого срока оцени-

вать иммунный ответ донорских клеток, обработанных различными агентами (Г. К. Бай-

муканова, Н. Н. Смирнова, 1977). Через 5 дней после переноса определяли число АОК в 

селезёнке реципиентов. 

Действие на T- и B-клетки. В опытах по изучению влияния "активированного" 

ЦФ на субпопуляции клеток селезёнки (T- и B-лимфоциты) была использована методика, 

 
- 9 -

в своих основных чертах аналогичная применённой ранее при изучении иммунологиче-

ской компетенции Т- и В-клеток при толерантности, индуцированной при помощи ЦФ 

(Л. Н. Фонталин и др., 1976). 

Влияние на пролиферацию T-клеток селезёнки. Для оценки пролиферации 

мышиных Т-клеток селезёнки использовали планшеты с адсорбированными антителами 

против CD3-рецептора Т-клеток (Biocoat anti-mouse CD3 T-cell activation plate, Becton 

Dickinson, Labware, Bedford, MA, США). Поскольку полноценная активация T-клеток по-

средством антител к CD3 нуждается в дополнительных стимулах, опосредуемых молеку-

лами межклеточного взаимодействия, в качестве отвечающих клеток использовали не-

очищенные спленоциты, содержащие вспомогательные клетки, которые экспрессируют 

LFA-3 и другие костимулирующие молекулы. После лизиса эритроцитов раствором 

NH4CL спленоциты отмывали дважды в изотоническом солевом растворе, забуференном 

фосфатами, и инкубировали при концентрации 107 клеток в 1 мл с ЦФ (1000 мкг/мл), 

МАФ (разные концентрации) или в их комбинации в течение 1 часа при 37 оC. Контроль-

ные клетки инкубировали без препаратов. Инкубацию прекращали добавлением холод-

ной среды, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, трижды отмывали и 

переносили в планшеты с антителами к CD3. Клетки инкубировали 72 часа в объёме 200 

мкл. За 8 часов до окончания культивирования в лунки добавляли 1 мкKu 3H-тимидина. 

Клетки переносили на фильтры с помощью автоматического харвестера (сборщика) кле-

ток и определяли уровень радиоактивной метки с помощью радиоспектрометрии лизата 

клеток, взятого из каждой лунки. По уровню включения радиоактивной метки судили о 

степени пролиферации клеток. Результаты выражали в имп./мин. 

Оценка иммунодепрессивного действия препаратов на лимфоциты человека. 

Лимфоциты из периферической крови (ЛПК) здоровых доноров обоего пола (51 человек) 

выделяли по методу Böyum (1968). Затем лимфоциты от каждого донора в количестве 

2×106 инкубировали с разными концентрациями "активной сыворотки" или ТиоТЭФ 

(объём инкубационной смеси составлял 1 мл) в течение 1 часа при 37 оC. Затем клетки 

трижды отмывали центрифугированием в охлаждённой до 4 оC средой 199 и оценивали 

их способность реагировать на митоген фитогемагглютинин (ФГА, производство Difco, 

США) в реакции бласттрансформации (РБТ). Методика постановки РБТ детально описа-

на в работе Л. Н. Веремко (1983). 

Определение фенотипа HLA (HLA-A, HLA-B и HLA-C) ЛПК исследуемых до-

норов. Типирование HLA-антигенов на поверхности ЛПК исследуемых лиц проводили