Практикум по биохимии сельскохозяйственной продукции

В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина

ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ
ПРОДУКЦИИ

Допущено Учебно-методическим объединением вузов Российской 
Федерации по агрономическому образованию в качестве учебного 
пособия для подготовки бакалавров, обучающихся по направлению 
110900 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции»

Санкт-Петербург
ГИОРД
2016

УДК 581.19
ББК 28.57
 
Р59

Рецензенты: Верхотуров В. В. – д. б. н., профессор Иркутской ГСХА;

 
Попов А. А. – к. х. н., доцент Якутской ГСХА

Рогожин В. В.
Р59 
 
Практикум по биохимии сельскохозяйственной продукции : учеб. пособие для вузов / В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина. — СПб. : ГИОРД, 2016. — 
480 с.

ISBN 978-5-98879-172-0

Основные цели практикума — ознакомление студентов с практическими методами биохимических исследований растительных и животных тканей, закрепление 
теоретических знаний в области биохимии сельскохозяйственной продукции, развитие экспериментальных навыков и привитие научного мировоззрения. В книге 
рассматриваются биохимические методы, используемые при подготовке образцов 
растительных и животных тканей к исследованию, а также способы определения 
и расчета содержания биологически активных веществ в исследуемых образцах сельскохозяйственной продукции.
Учебное пособие предназначено для студентов сельскохозяйственных вузов, 
обучающихся по специальности 110900 «Технология производства и переработки 
сельскохозяйственной продукции», по направлению подготовки бакалавров, а также 
может быть использовано студентами биологических, технических и пищевых вузов 
и научными работниками.

УДК 581.19
ББК 28.57

ISBN 978-5-98879-172-0 
© ООО «Издательство „ГИОРД“», 2016

Оглавление

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

ВВЕДЕНИЕ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

ГЛАВА 1. ПРАВИЛА И МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ  . . . . . 16
  1.1. Правила техники безопасности при проведении
 
исследований в биохимической лаборатории  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
  1.2. Физико-химические методы анализа  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
  1.3. Подготовка сельскохозяйственной продукции
 
для биохимических исследований . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
  1.4. Приготовление тканей к исследованию . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
  1.5. Методы разделения биогенных молекул  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
  1.6. Методы выделения субклеточных фракций. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
  1.7. Методы концентрирования  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
  1.8. Методы приготовления, определения и расчета
 
концентрации вещества в растворе  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
  1.9. Методы расчета экспериментальных данных  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
 1.10. Порядок записи лабораторной работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

ГЛАВА 2. УГЛЕВОДЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
  2.1. Определение глюкозы в биологических жидкостях
 
о-толуидиновым методом  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
  2.2. Определение глюкозы с помощью антрона  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
  2.3. Определение содержания сиаловых кислот по реакции с резорцином. . . 80
  2.4. Определение сиаловых кислот в биологических
 
жидкостях по методу Гесса  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
  2.5. Определение целлюлозы (по Кюршнеру и Ганеку). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
  2.6. Определение крахмала в тканях растений  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
  2.7. Выделение и очистка сахарозы из сахарной свеклы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
  2.8. Выделение крахмала из зерновок злаковых культур. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
  2.9. Выделение крахмала из клубней картофеля. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
 2.10. Выделение гликогена из животных тканей  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
 2.11. Гидролиз гликогена. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
 2.12. Ферментативный гидролиз целлюлозы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

ГЛАВА 3. ЛИПИДЫ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ  . . . . . . . . . . . . . 96
  3.1. Растворимость липидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
  3.2. Количественные показатели растворения липидов
 
растительного масла в хлороформе и этанольно 
хлороформных смесях  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
  3.3. Экстракция липидов из субклеточных частиц. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Оглавление

6

  3.4. Определение содержания общих липидов
 
в растительных тканях  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
  3.5. Определение холестерина (метод Илька) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
  3.6. Выделение общих липидов из мышечной ткани. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
  3.7. Фракционирование липидов методом тонкослойной хроматографии  . . . 106
  3.8. Исследование перекисного окисления липидов (ПОЛ)  . . . . . . . . . . . . . . 108
  3.9. Определение общей антиокислительной активности (АОА)  . . . . . . . . . . 109
 3.10. Определение содержания водорастворимых антиоксидантов  . . . . . . . . . 111
 3.11. Определение общего содержания антиоксидантов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
 3.12. Определение содержания антиоксидантов в гомогенатах тканей
 
по Глевинду  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

ГЛАВА 4. АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
  4.1. Определение аминокислот с помощью нингидрина  . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
  4.2. Определение содержания глутаминовой кислоты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
  4.3. Определение содержания белка спектрофотометрическим методом  . . . 125
  4.4. Определение общего белка по биуретовой реакции. . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
  4.5. Метод определения белка по Лоури  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
  4.6. Метод определения белка по Брэдфорду  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
  4.7. Определение содержания гемоглобина крови
 
гемоглобинцианидным методом  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
  4.8. Определение концентрации гемоглобина (по Д. Драбкину). . . . . . . . . . . 135
  4.9. Определение церулоплазмина (феррооксидазы) в плазме крови  . . . . . . . 136
 4.10. Метод выделения пептидов из тимуса теленка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
 4.11. Выделение и очистка гемоглобина  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
 4.12. Выделение фибриногена из плазмы крови. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
 4.13. Выделение яичного альбумина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
 4.14. Получение кристаллического яичного альбумина  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
 4.15. Использование метода гель-хроматографии
 
для определения молекулярной массы гемоглобина  . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
 4.16. Изучение кислотной денатурации белков  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
 4.17. Изучение температурной денатурации белков  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
 4.18. Кислотный гидролиз белков. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
 4.19. Щелочной гидролиз белков  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
 4.20. Исследование взаимодействий нативной
 
и денатурированных форм альбумина с кальцием  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

ГЛАВА 5. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
  5.1. Выделение и качественные реакции 
 
на дезоксирибонуклеопротеин селезенки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
  5.2. Выделение ДНК из животных тканей. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
  5.3. Метод определения содержания ДНК с помощью дифениламина  . . . . . 160
  5.4. Метод выделения ДНК растительных тканей  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
  5.5. Выделение РНК и ДНК фенольным методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
  5.6. Выделение РНК из печени (по Шерреру)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
  5.7. Определение содержания РНК с орцином (по Мейбаум) . . . . . . . . . . . . . 165

Оглавление

7

  5.8. Выделение РНК из рибосом гепатоцитов печени. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
  5.9. Гидролиз ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
 5.10. Определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
 
(по А. С. Спирину)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
 5.11. Определение содержания пуриновых оснований . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

ГЛАВА 6. ЭЛЕМЕНТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
  6.1. Определение общего азота в растительных тканях (по А. Т. Усовичу) . . . 174
  6.2. Определение фосфора ванадо-молибдатным методом  . . . . . . . . . . . . . . . 176
  6.3. Определение неорганического фосфора методом Фиске-Суббароу . . . . 178
  6.4. Определение марганца в растительных тканях
 
формальдоксимным методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
  6.5. Определение калия и натрия на пламенном фотометре  . . . . . . . . . . . . . . 181
  6.6. Определение железа роданидным методом  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
  6.7. Определение железа с помощью 4,7-дифенил-1,10 
фенатролин-3,6-дисульфоновой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
  6.8. Определение меди в гомогенатах тканей  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
  6.9. Определение меди в тканях методом Шмидта
 
в модификации А. Г. Рахманкулова и И. А. Коптевой. . . . . . . . . . . . . . . . . 187
 6.10. Определение кальция в сыворотке крови с помощью
 
глиоксаль-бис-2-оксианила  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
 6.11. Определение магния в сыворотке крови с помощью
 
титанового желтого. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
 6.12. Определение ионов хлора в сыворотке крови
 
меркуриметрическим методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

ГЛАВА 7. ВИТАМИНЫ, КОФЕРМЕНТЫ И ПИГМЕНТЫ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
  7.1. Определение содержания аскорбиновой кислоты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
  7.2. Выделение и очистка дигидрокверцетина (витамина
 
группы Р) из лиственницы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
  7.3. Изучение физических свойств дигидрокверцетина  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
  7.4. Энзиматический метод получения кверцетина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
  7.5. Выделение убихинона (коэнзима Q) из митохондрий  . . . . . . . . . . . . . . . . 206
  7.6. Определение содержания убихинона  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
  7.7. Определение содержания НАДФ+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
  7.8. Определение содержания НАД+. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
  7.9. Получение вытяжки пигментов из побегов пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . . 212
 7.10. Разделение пигментов по Краусу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
 7.11. Количественное определение хлорофиллов и каротиноидов. . . . . . . . . . 214
 7.12. Омыление хлорофиллов щелочью . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
 7.13. Получение хлорофилла  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
 7.14. Разделение пигментов методом бумажной хроматографии  . . . . . . . . . . . 217
 7.15. Получение гемина с помощью органического растворителя  . . . . . . . . . . 220
 7.16. Получение гемина с помощью пепсина  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
 7.17. Определение концентрации гемина  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

Оглавление

8

 ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
   8.1. Физико-химические методы исследования ферментов. . . . . . . . . . . . . . 229
   8.2. Методы очистки ферментов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
   Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269

 ГЛАВА 9. МОЛЕКУЛЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ. . . . . . . . . . . . . . . . . 271
   9.1. Определение АТФ и глюкозо-6-фосфата  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
   9.2. Определение АТФ с помощью люциферазы
 
(по Угаровой и Бровко)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276
   9.3. Определение глутатиона в растительных тканях. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278
   9.4. Определение содержания глутатиона методом
 
титрования с помощью n-хлормеркурибензоата. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
   9.5. Определение содержания в биогенных тканях
 
креатинфосфата по фосфору  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
   Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282

ГЛАВА 10. МЕТАБОЛИТЫ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
  10.1. Определение нитритов в растительных тканях  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
  10.2. Определение нитратов в растительных тканях  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
  10.3. Определение содержания мочевины по реакции
 
с диацетилмонооксимом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
  10.4. Определение мочевой кислоты по методу Мюллера-Зейферта  . . . . . . . 291
  10.5. Определение содержания креатинина по цветной реакции Яффе  . . . . 292
  10.6. Определение содержания креатина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
  10.7. Определение содержания пировиноградной кислоты
 
с помощью лактатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
  10.8. Определение содержания пировиноградной кислоты
 
в животных тканях  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
  10.9. Определение пировиноградной кислоты в растительных тканях  . . . . . 299
 10.10. Определение содержания молочной кислоты с помощью
 
n-оксидифенила  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
 10.11. Определение содержания молочной кислоты в биогенных
 
тканях энзиматическим методом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
 10.12. Определение фосфотриоз  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
 10.13. Определение этанола в биологическом материале . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309

ГЛАВА 11. МЕТАБОЛИЗМ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310
  11.1. Определение активности пероксидазы в супернатанте
 
зерновок пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314
  11.2. Определение активности пероксидазы по ферроцианиду калия . . . . . . 316
  11.3. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
  
окисления этанола по НАДН  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
  11.4. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
 
окисления этанола по йоднитротетразолиевому фиолетовому  . . . . . . . 319
  11.5. Определение активности алкогольдегидрогеназы
 
в реакции восстановления ацетальдегида. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
  11.6. Определение активности альдегиддегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
  11.7. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
  
по НАДФН. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324

Оглавление

9

  11.8. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
 
по йоднитротетразолиевому фиолетовому. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
  11.9. Определение активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . 327
 11.10. Определение активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы. . . . . . . . . 329
 11.11. Определение активности триозофосфатизомеразы  . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
 11.12. Определение активности глицеральдегид-3 
фосфатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332
 11.13. Определение активности лактатдегидрогеназы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334
 11.14. Определение активности ферментов пируватдегидрогеназного
 
комплекса. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336
 11.15. Определение активности ферментов ПДК с помощью
 
йоднитротетразолиевого фиолетового  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
 11.16. Определение активности ферментов
 
кетоглутаратдегидрогеназного комплекса  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339
 11.17. Определение активности глутаматдегидрогеназы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341
 11.18. Определение активности цитохромоксидазы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343
 11.19. Определение активности сукцинатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345
 11.20. Определение активности НАД+-зависимой малатдегидрогеназы  . . . . . 346
 11.21. Определение активности НАДФ+-зависимой
 
малатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348
 11.22. Определение активности нитратредуктазы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
 11.23. Определение активности аскорбатоксидазы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352
 11.24. Определение активности полифенолоксидазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353
 11.25. Определение активности НАДФ+-зависимой
 
изоцитратдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
 11.26. Определение активности каталазы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
 11.27. Определение активности аминотрансфераз. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357
 11.28. Определение активности гексокиназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 360
 11.29. Определение активности пируваткиназы с помощью
 
лактатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
 11.30. Определение активности 3-фосфоглицераткиназы
 
с помощью глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . 363
 11.31. Определение активности креатинкиназы с помощью
 
сложной энзиматической системы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366
 11.32. Определение активности фосфоглюкомутазы
 
с помощью Г6ФДГ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368
 11.33. Определение активности щелочной фосфатазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370
 11.34. Определение активности аргиназы печени  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
 11.35. Определение активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы. . . . . . . . . 375
 11.36. Определение активности глюкозофосфатизомеразы
 
с помощью Г6ФДГ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379

ГЛАВА 12. ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .381
  12.1. Определение алкалоидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
  12.2. Определение стероидных гликоалкалоидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
  12.3. Определение стероидных (сердечных) гликозидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . 388
  12.4. Выделение и определение капсаицинов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391

Оглавление

  12.5. Выделение и определение сапонинов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393
  12.6. Определение флавоноидов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
  12.7. Определение алкилрезорцинолов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 396
  12.8. Определение госсипола . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 398
  12.9. Определение дубильных веществ в семенах. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
  Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403

ГЛАВА 13. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА . . . . . . 404
  13.1. Определение плотности молока и молочных продуктов . . . . . . . . . . . . . 407
  13.2. Определение титруемой кислотности молока
 
и молочных продуктов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
  13.3. Определение рН молока  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
  13.4. Определение массовой доли влаги и сухого вещества в молоке,
 
сметане, мороженом, сырах, твороге и творожных изделиях  . . . . . . . . . 412
  13.5. Методы осаждения белково-липидных комплексов молока  . . . . . . . . . 413
  13.6. Выделение казеина из молока  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418
  13.7. Методы растворения липидов сливочного масла
 
в этиловом спирте и хлороформе. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
  13.8. Активность химозина или ферментативного сычужного комплекса. . . 420
  13.9. Качественные реакции на присутствие посторонних
 
соединений в молоке  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422
 13.10. Выделение лактозы из молочной сыворотки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
 13.11. Метод определения содержания аскорбиновой кислоты в молоке  . . . . 426
 Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 428

ГЛАВА 14 БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ МЫШЦ  . . . . . . . 429
  14.1. Выделение митохондрий скелетных мышц  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430
  14.2. Выделение митохондрий сердечной мышцы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
  14.3. Выделение белков мышечной ткани . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
  14.4. Выделение и очистка миоглобина мышц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433
  Контрольные вопросы и задания  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435

ПРИЛОЖЕНИЯ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436
Приложение 1. Способы расчета содержания биогенных соединений 
в исследуемых жидкостях и тканях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436
Приложение 2. Величины рН буферных растворов и их кислотные
и щелочные компоненты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439
Приложение 3. Значения молекулярных масс основных соединений. . . . . . . . . 441
Приложение 4. Основные приборы, необходимые для выполнения 
биохимических исследований . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448

СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ААС 
— атомно-абсорбционная спектроскопия
АДГ 
— алкогольдегидрогеназа
АК 
— аскорбиновая кислота
АлТ 
— аланинаминотрансфераза
АльДГ 
— альдегиддегидрогеназа
АО 
— антиоксиданты
АОС 
— антиокислительная активность
АсТ 
— аспартатаминотрансфераза
АТФ 
— аденозинтрифосфорная кислота
БАВ 
— биологически активные вещества
б. в. 
— бидистиллированная вода
БСА 
— бычий сывороточный альбумин
ВЖК 
— высшие жирные кислоты
Г6ФДГ 
— глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
Галь3ФДГ — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
д. в. 
— дистиллированная вода
ДГ 
— дигоксин
ДГКВ 
— дигидрокверцетин
ДМСО 
— диметилсульфоксид
ДНК 
— дезоксирибонуклеиновая кислота
2,4-ДНФ — 2,4-динитрофенол
ДФПГ 
— дифенилпикрилгидразил
ИК 
— инфракрасный
ИНТФ 
— йоднитротетразолий фиолетовый
КДК 
— кетоглутаратдегидрогеназный комплекс
КРС 
— крупный рогатый скот
ЛДГ 
— лактатдегидрогеназа
МДА 
— малоновый диальдегид
МДГ 
— малатдегидрогеназа
НАД+ 
— никотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДН 
— никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФ+ 
— никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
НАДФН 
— никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
НЖК 
— ненасыщенные жирные кислоты
ОДН 
— о-дианизидин (3,3′-диметоксибензидин)

Принятые сокращения

ПДК — пируватдегидрогеназный комплекс
ПОЛ — перекисное окисление липидов
ПХ 
— пероксидаза корней хрена
РНК 
— рибонуклеиновая кислота
СДГ 
— сукцинатдегидрогеназа
СФ 
— спектрофотометр
ТБК 
— тиобарбитуровая кислота
α-ТК — α-токоферол
ФЭК — фотоэлектроколориметр
ЭДПК — 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид
ЭФП — эмиссионная фотометрия пламени

Кд 
— константа диссоциации
Ka 
— константа активирования
Ki 
— константа ингибирования
Km 
— константа Михаэлиса
Vm 
— максимальная скорость ферментативной реакции
kcat 
— каталитическая константа
v0 
— начальная скорость ферментативной реакции
RZ 
— показатель чистоты пероксидазы [равен отношению величин
 
 
светопоглощения (D403  /D280)]

ВВЕДЕНИЕ

Биохимия сельскохозяйственной продукции относится к наукам, изучающим химический состав, структуру и свойства биогенных молекул 
растительных и животных тканей. Предметом исследования биохимии 
являются метаболические процессы в клетках растений и животных, 
а также регуляторные механизмы, обеспечивающие функционирование 
целостного организма.
Биохимия сельскохозяйственной продукции в настоящее время является динамично развивающейся наукой, поэтому для понимания новых 
методов исследования требуются высококвалифицированные лаборанты, 
способные не только освоить современное оборудование и высокоточные 
приборы, но и проанализировать полученные данные биохимических исследований. Биохимия занимает достойное место среди фундаментальных 
наук, изучающих жизнедеятельность растений в период их роста и развития, а также во время созревания, плодоношения и хранения. Поэтому 
предлагаемый практикум может быть полезен специалистам, занимающимся аналитическими исследованиями в современных биохимических 
лабораториях. Особое внимание в книге уделяется изучению состава биогенных молекул, исследованию биохимических процессов в растительных 
и животных тканях в период их длительного хранения и переработки.
В настоящее время постоянно совершенствуются методы биохимических исследований, создаются высокоточные приборы, позволяющие 
получать в большом объеме новую информацию о структуре и свойствах 
биогенных молекул, обеспечивающих участие и синхронность протекания метаболических процессов в живых организмах. Поэтому назрела необходимость в пособии, отражающем современные методы исследования 
в биохимии растений и возможность их практического использования 
лаборантами биохимических лабораторий.
Современному аналитику требуются знания основ физико-химических методов исследования, умение работать на современных высокоточных приборах и владеть средствами обработки результатов эксперимента. 
Для проведения исследований необходимо на основании анализа литературы по исследуемой проблеме выдвинуть гипотезу и предложить путь 
и способы ее решения. Доказательная база исследований должна быть 
основана на достоверности полученных результатов, связанных между 
собой единством взаимодополняющих решений и в совокупности дока

Введение

14

зывающих наличие выявленных процессов и закономерностей их протекания. Подтверждением гипотезы является возможность управления 
выявленными процессами в живых организмах. Уже сейчас знание устройства биогенных систем позволяет создавать искусственные живые 
организмы, а также получать трансгенные растительные организмы, устойчивые к действию различных стрессирующих факторов и обладающие 
высокой продуктивностью.
В данном практикуме представлены работы, позволяющие изучить химический состав тканей растений, а также их семян и плодов. Кроме того, 
объектом аналитических исследований служат продукты жизнедеятельности животных и продукты их переработки — мясо, молоко и молочные продукты. Поэтому в пособии представлены работы по изучению химического 
состава молока и молочных продуктов (сыр, масло, мороженое, сметана, 
творог и др.), а также исследования процессов в молочной железе, основу 
которой составляют железистая и соединительная ткани. Изучается химический состав мяса и процессы, протекающие при его созревании.
В книге приводятся методы статистического обсчета экспериментальных данных, описание основных аналитических приборов и оборудования. 
Особое внимание уделяется приемам и методам правильного использования аналитических приборов, позволяющим избежать ошибок при выполнении биохимических исследований. Подробно рассмотрены методы обсчета экспериментальных данных, приводятся различные способы расчета 
концентраций вещества в растворе. В качестве практических задач студентам предлагается определить концентрацию вещества в растворе, максимум 
его светопоглощения и рассчитать молярный коэффициент светопоглощения. Подробно описаны методы сбора растительного сырья и способы его 
сушки. Студенты познакомятся с методами подготовки образцов растительных тканей к различным биохимическим исследованиям.
В практикум включены работы, знакомящие студентов с современными методами исследования и проблемами биохимии, такими как ионообменная хроматография, гель-фильтрация, определение каталитических 
свойств ферментов, методы титрования активных центров ферментов 
и др. Приводятся работы по выделению ферментов и изучению механизмов их действия.
В целом, аналитические работы приспособлены для исследования 
различных биологических объектов и предназначены для качественноколичественной оценки содержания исследуемых биогенных соединений. Анализ полученных данных позволит студенту прогнозировать ход 
биохимических процессов в соответствии с принципами биохимической 
энергетики и в зависимости от условий окружающей среды, а также применять знания о химическом составе при оценке пищевой и кормовой 
ценности растительной продукции и пригодности ее к переработке.

Введение

Аналитические исследования дают возможность студентам обосновывать изменения химического состава растительной продукции в зависимости от фазы развития, природно-климатических условий, плодородия 
почвы, влагообеспеченности и режима питания растений, различных приемов агротехники. Освоение современных методов исследований позволит применять знания о химическом составе и биохимических процессах 
при обосновании технологий производства, послеуборочной обработки, 
хранения и переработки растительной продукции, а также использовать 
биохимические показатели при оценке качества и безопасности молочной 
и мясной продукции, применять знания о биохимических процессах при 
обосновании технологий производства, хранения и переработки продукции животноводства.
В издание включен словарь терминов, что поможет студентам ознакомиться с основными терминами и понятиями биохимии.
Практикум предназначен для студентов технических факультетов сельскохозяйственных вузов и по своему содержанию соответствует программе курса «Биохимия сельскохозяйственной продукции».
Освоение практических знаний и навыков по биохимии позволит студенту использовать их при изучении других предметов на старших курсах 
(биотехнология, биоинженерия, энзимология, агрохимия, кормопроизводство, растениеводство и др.).
Перед выполнением каждой лабораторной работы приводится краткий 
теоретический курс по исследуемой теме, а также дано описание принципа 
метода исследования, приводятся подробные методики приготовления рабочих растворов и проведения лабораторной работы. По завершению выполнения работы студентам предлагается написать основные выводы по проведенному исследованию и ответить на некоторые теоретические вопросы.
Практикум может быть интересен и работникам, занимающимся научными исследованиями, так как в него включены работы повышенной 
сложности, связанные с изучением активности ферментов, определением содержания антиоксидантов, перекисного окисления липидов и др. 
В приложении приводится краткий перечень и описание современных 
отечественных и лучших зарубежных приборов и оборудования, необходимых для оснащения биохимических лабораторий.

ГЛАВА 1 
ПРАВИЛА И МЕТОДЫ
 
 
БИОХИМИЧЕСКИХ
 
 
ИССЛЕДОВАНИЙ

Современные биохимические исследования проводятся на основе тщательного анализа всех этапов лабораторного процесса, начиная 
от пробоподготовки до обработки результатов. При выполнении биохимических работ используют современные аналитические приборы и оборудование, приспособленные для работы практически с любыми видами 
биологического материала. Для автоматизации биохимических исследований разработаны анализаторы, которые предназначены для проведения 
всех основных биохимических исследований, в том числе: определение 
электролитов, субстратов, ферментов, специфических белков, фитогормонов, вторичных метаболитов и других веществ. Биохимические анализаторы используют меню тестов, обновляемые программные обеспечения 
и в перспективе планируется создание полностью автоматизированных 
лабораторий. Биохимические анализаторы способны выполнять в автоматическом режиме как специальные, так и традиционные биохимические 
исследования. Биохимические анализаторы могут быть укомплектованы 
роботами-манипуляторами, высокопроизводительными лабораторными 
центрифугами, системами обработки информации и другими вспомогательными устройствами, позволяющими полностью автоматизировать 
процессы пробоподготовки, получения, сбора, выдачи и хранения информации. 
Освоение этих сложных лабораторных приборов требует от специалистов как теоретических, так и практических знаний в области биохимии. Поэтому начинающему аналитику необходимо освоить основы 
лабораторных исследований по подготовке образцов, овладеть навыками 
построения калибровочных графиков, понять принципы методов исследования качественного и количественного состава биогенных молекул 
в различных сельскохозяйственных продуктах, уметь рассчитать концентрацию раствора, точно взять навеску вещества, освоив методы работы 
с высокоточными аналитическими весами, правильно пользоваться автоматической пипеткой. 
Выполнение биохимических исследований требует от студента знаний 
по приготовлению гомогената и супернатанта биогенных тканей, а это значит, что студент должен уметь работать с гомогенизаторами и центрифугами,