Молекулярно-генетические методы в исследовании растений

Екатеринбург

Издательство Уральского университета

2017

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ ПЕРВОГО ПРЕЗИДЕНТА РОССИИ Б. Н. ЕЛЬЦИНА

Н. А. Кутлунина, А. А. Ермошин

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

В ИССЛЕДОВАНИИ РАСТЕНИЙ

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методическим советом УрФУ

для студентов, обучающихся по программам бакалавриата

по направлениям подготовки

06.03.01 «Биология», 05.03.06 «Экология и природопользование»

ББК 575.088(07)
        К95

В учебно-методическом пособии рассмотрены современные подходы

к молекулярно-генетическим исследованиям растений. Подробно показаны
методы анализа изоферментов и нуклеиновых кислот. В пособие включены
лабораторные работы для больших и малых спецпрактикумов.

Рекомендуется студентам для самостоятельной работы и выполнения

лабораторных работ при изучении дисциплин «Физические методы в биоло-
гии», «Филогения и филогеография» и др.

Кутлунина, Н. А.

Молекулярно-генетические методы в исследовании рас-

тений : учеб.-метод. пособие / Н. А. Кутлунина, А. А. Ермо-
шин ; М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. фе-
дер. ун-т. – Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2017. – 142 с.

ISBN 978-5-7996-2142-1

К95

ISBN 978-5-7996-2142-1

Р е ц е н з е н т ы:

лаборатория филогенетики и биохронологии

Института экологии растений и животных УрО РАН

(заведующий лабораторией доктор биологических наук А. В. Бородин);

А. Х. Баймиев, доктор биологических наук,

заведующий лабораторией молекулярной биологии

и нанобиотехнологии;

Б. Р. Кулуев, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

(Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН)

ББК 575.088(07)

© Уральский федеральный университет, 2017

На обложке:

камера для горизонтального электрофореза и источник тока фирмы Bio-Rad;

электрофореграмма ПЦР-продуктов в агарозном геле

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие ............................................................................................................ 6

1. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ ............................................................................... 8

1.1. Принцип метода электрофореза белков.

Электрофоретическая подвижность ....................................................... 8

1. 2. Классификация электрофоретических методов ................................. 11
1.3. Особенности электрофореза в полиакриламидном геле ................. 14
1.4. Нативный и SDS-ПААГ-электрофорез ................................................. 16
1.5. Диск-электрофорез ................................................................................... 17
1.6. Аллозимный анализ .................................................................................. 17
Лабораторная работа 1
Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях .................. 22
Лабораторная работа 2
Проявление электрофореграмм с помощью красителя кумасси .......... 25
Лабораторная работа 3
Определение молекулярной массы белка в геле ....................................... 26
Лабораторная работа 4
Нативный электрофорез. Выявление
изоферментных спектров пероксидазы ....................................................... 27
Лабораторная работа 5
Выявление изоферментных спектров супероксиддисмутазы ................ 29
Лабораторная работа 6
Изоферментный анализ генетического полиморфизма
в популяции растений ...................................................................................... 30

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ............................................................................................ 35

2.1. Растительный материал для выделения ДНК ....................................... 35
2.2. Особенности выделения ДНК из растительных объектов ................ 35
Лабораторная работа 7
Метод солевой экстракции ДНК с фенольной депротеинизацией ........ 40
Лабораторная работа 8
Выделение суммарной ДНК из растений по Devey et al.
с небольшими модификациями .................................................................... 42

Лабораторная работа 9
Выделение геномной ДНК (с мочевиной) .................................................. 43
Лабораторная работа 10
Быстрый метод выделение ДНК из растительных тканей ........................ 45
Лабораторная работа 11
Выделение ДНК растений с использованием СТАВ ................................. 46
Лабораторная работа 12
Дополнительная очистка ДНК ....................................................................... 48

3. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ ПРЕПАРАТОВ ДНК И РНК ............................ 50

Лабораторная работа 13
Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК .................. 51
Лабораторная работа 14
Определение концентрации нуклеиновых кислот микрометодом ........ 53

4. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ..................................................... 56

4.1. Суть метода ПЦР ....................................................................................... 56
4.2. Модификации метода ПЦР ...................................................................... 69
4.3. Преимущества ПЦР перед другими методами ................................... 77
4.4. Практическое применение  и перспективы развития метода ПЦР   78
Лабораторная работа 15
Проведение ПЦР-амплификации ДНК с ISSR-праймерами ................... 79
Лабораторная работа 16
Проведение ПЦР-амплификации ДНК с ITS-праймерами ..................... 81
Лабораторная работа 17
Определение наличия ГМО в продуктах питания ..................................... 82

5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ........................................... 84

Лабораторная работа 18
Электрофорез в 6 % полиакриламидном денатурирующем геле
и процедура окраски полиакриламидных гелей нитратом серебра ...... 88
Лабораторная работа 19
Электрофорез в 1 % агарозном геле и ТАЕ-буфере ................................. 90
Лабораторная работа 20
Выделение ДНК из агарозного геля  и ее очистка ..................................... 91

6. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ......................................................................................... 94

6.1. Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту:

метод химической деградации ............................................................... 94

6.2. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: «плюс-минус» метод ................ 96
6.3. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод «терминаторов» ............. 97
6.4. Автоматическое секвенирование ДНК ............................................... 101
6.5. Методы секвенирования нового поколения ...................................... 101
Лабораторная работа 21
Подготовка образцов к сиквенсной реакции.
Метод прямого переосаждения ДНК в мягких условиях ....................... 105

7. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ................. 108

7.1. Особенности растительного генома ................................................... 108
7.2. Молекулярные маркеры ........................................................................ 109
7.3. RAPD-анализ ............................................................................................. 113
7.4. ISSR-маркирование ................................................................................. 114
7.5. SSR-маркеры ............................................................................................. 116
7.6. AFLP-метод ................................................................................................ 118
7.7. SNP .............................................................................................................. 120

Список библиографических ссылок .............................................................. 122

Глоссарий ............................................................................................................. 126

Учебное оборудование ..................................................................................... 138

ПРЕДИСЛОВИЕ

Биология – самая быстро развивающаяся наука второй поло-

вины ХХ и ХХI в. Крупные открытия в биологии (выявление струк-
туры ДНК, полимеразная цепная реакция, создание ДНК-чипов, сек-
венирование), а также значительно возросшие технические воз-
можности позволили сформироваться науке молекулярной биологии
и целой группе методов, известных как молекулярные или молеку-
лярно-генетические методы. В настоящее время эти методы актив-
но применяются не только в биологии, но и в других областях:
медицине, криминалистике, археологии.

Современную биологию невозможно представить без молеку-

лярно-генетических методов. Первыми были методы, основанные
на полиморфизме белков. Изоферментный анализ позволяет выяв-
лять уровень полиморфизма популяций, их генетическую структу-
ру, определять уровень генетической закрытости или, наоборот,
открытости популяций и многое другое. В настоящее время эти ме-
тоды продолжают использоваться, но большинство исследователей
и лабораторий переходят на анализ полиморфизма нуклеиновых
кислот. Отчасти это связано с тем, что белки можно выделять толь-
ко из живого материала или из замороженного при температуре
–70–80 оС, тогда как ДНК можно выделять и из живого, и из высушен-
ного материала. Кроме того, методы ДНК-анализа позволяют изу-
чать как ядерный, так и пластидный и митохондриальный гено-
мы. В связи с этим молекулярно-генетические методы, основанные
на полимеразной цепной реакции и секвенировании ДНК, актив-
но используются в таких областях исследования растений, как:

– генетический полиморфизм природных популяций;
– анализ чистоты сортов;
– выявление гибридов;
– выявление филогенетических связей видов, родов и таксо-

нов более высокого уровня;

– анализ транскрипционной активности генов.

При изучении обязательных курсов на биологическом факуль-

тете студенты знакомятся с современными методами анализа, в том
числе молекулярно-генетическими. Выпускники, владеющие этими
методами, востребованы в лабораториях и исследовательских цент-
рах города, области и региона. В последние годы опубликовано
большое количество монографий и пособий, охватывающих широ-
кий круг вопросов молекулярной биологии. В то же время каждый
научный центр имеет свою специфику, пользуется своими наработ-
ками и методиками. Поэтому цель данного учебно-методического
пособия – систематизировать методики, которые используются
при исследовании растений. Важной особенностью пособия явля-
ется наличие теоретических разделов, которые способствуют по-
ниманию практического материала и служат опорой при самостоя-
тельной работе студентов.

При написании пособия использовались монография В. Е. Па-

дутова с соавт. (2007), статьи Е. К. Хлесткиной (2011, 2013) и Н. А. Ря-
бушкиной с соавт. (2012), а также учебно-методические пособия
И. В. Стручковой и Е. А. Кольясовой (2012), В. А. Великова (2013),
«Основы полимеразной цепной реакции» (2012) и др.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов-

бакалавров и магистрантов, изучающих молекулярно-генетические
курсы и выполняющих квалификационные работы по соответствую-
щей тематике, а также для аспирантов и научных сотрудников.

1.  ЭЛЕКТРОФОРЕЗ  БЕЛКОВ

Метод электрофореза, предложенный еще в начале ХХ в., сей-

час широко используют в биологии и медицине для разделения бел-
ков в исследовательских и клинических целях. С помощью элект-
рофореза можно разделить на отдельные компоненты белковую
смесь, что позволяет установить молекулярную массу белка или его
субъединиц, подтвердить чистоту выделенного белка.

Электрофорезом называют движение заряженных частиц

в растворе под действием электрического поля.

Электрофоретический метод в биохимии – это способ про-

странственного разделения молекул, имеющих разный заряд и раз-
меры, путем помещения их в электрическое поле.

Результатом проведения электрофореза является электрофо-

реграмма – картина, полученная после разделения сложной смеси
с помощью электрофореза и специфического проявления. Электро-
фореграммы белков-ферментов (зимограммы) позволяют изучать
изменения активности и изоферментного спектра белков под дей-
ствием внешних и внутренних факторов как у растений, так и у дру-
гих организмов.

1.1. Принцип метода электрофореза белков.

Электрофоретическая подвижность

В растворе белки находятся в виде заряженных частиц. Заряд

на поверхности белков возникает в результате диссоциации груп-
пировок, находящихся в боковых радикалах аминокислот (карбок-
сильных, амино-, имидазольных и других групп), а также при свя-
зывании ионов. Так как степень диссоциации группировок зависит
от рН раствора, то величина и знак суммарного заряда белковой
молекулы зависят от рН среды, а также от ионной силы (интен-
сивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе).

Для расчета ионной силы следует найти произведение концент-

рации каждого иона на квадрат его заряда, сложить все получен-
ные величины и итоговую сумму разделить пополам. Если в раство-
ре присутствуют два или более электролитов, то вычисляется общая
суммарная ионная сила раствора. Для каждого белка существует
такое значение рН среды (обозначаемое как рI – изоэлектричес-
кая точка), при котором положительные и отрицательные заряды
ионизированных групп скомпенсированы, поэтому заряд всей бел-
ковой молекулы равен нулю. В буфере с рН, равным рI изучаемого
белка, отсутствие заряда на белковой молекуле делает невозможным
ее движение в электрическом поле. Из-за разницы в аминокислот-
ном составе разные белки имеют разные значения рI. При рН  pI
молекулы белка приобретают заряд и под действием электрическо-
го поля перемещаются к противоположно заряженному электроду –
катоду (–) или аноду (+). Например, кислые белки, богатые моноами-
нодикарбоновыми аминокислотами (асп, глу), в слабощелочном
буфере приобретут отрицательный суммарный заряд из-за диссо-
циации СООН-групп до СОО– и H+ и будут двигаться к аноду.

Для электрофоретического разделения оптимально такое зна-

чение рН рабочего буфера, которое обусловливает максимальное
различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь,
а не их максимальный заряд. Обычно электрофорез проводят
в среде (буфере) со значением рН, на 3–4 единицы отличающим-
ся от среднего значения рI для белков данного типа. Это позволяет
добиться хорошей электрофоретической подвижности и вместе
с тем сохранить ощутимые различия молекул по заряду. Предпоч-
тительно использовать буфер известной и постоянной ионной силы
на основе однозарядных ионов. От рабочего буфера также требует-
ся существенная емкость, так как локальная концентрация белка
в образующихся при разделении смеси зонах скопления молекул
может оказаться значительной. Поэтому используют буферы с кон-
центрацией не менее 0,1–0,2 М.

При проведении электрофореза электрическое поле создают

с помощью источника питания – стабилизированного выпрями-
теля, способного давать регулируемое напряжение до 500–1000 В

при силе тока в несколько десятков миллиампер (мА). Напряже-
ние на участке электрической цепи равно разности потенциалов
на концах этого участка, если на этом участке нет источника сторон-
них сил, разделяющих разноименные заряды. При электрофорезе
участок электрической цепи – это буфер. Электрофорез проводят
в однородном электрическом поле, т. е. поле, напряженность (E)
которого во всех точках одинакова. Электрический ток пропускают
через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изоли-
рующего материала (например, стекла) или пропитывающий ка-
кую-либо поддерживающую среду-носитель (например, бумагу
или гель). Сопротивление (R) буферного раствора задается двумя фак-
торами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоре-
тической подвижностью. Электрофоретической подвижностью (u)
данной молекулы называют скорость движения заряженной моле-
кулы (см/ч) в электрическом поле с напряженностью 1 В/см. Еди-
ницей электрофоретической подвижности является см2/ч В.

Именно различия в электрофоретической подвижности бел-

ков, содержащихся в анализируемой смеси, позволяют разделить
эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).
Скорость (V) движения белков к тому или иному электроду снижа-
ется из-за их трения об окружающую среду. Сила трения (или, ина-
че, сила сопротивления окружающей среды) прямо пропорциональна 
скорости движения белковых молекул. Коэффициент трения
белковой молекулы, обозначенный как f, зависит от размера, формы, 
степени гидратированности этой молекулы и от свойств самой
среды. При электрофорезе работа силы трения заряженных компонентов 
разделяемой смеси о среду приводит к нагреву геля. Кроме
того, образование тепла вызывается прохождением электрического
тока. В итоге происходит значительное возрастание температуры,
которое ухудшает результаты электрофоретического разделения,
так как изменяет вязкость и проводимость среды, увеличивает скорость 
диффузии молекул, способствует испарению летучих компонентов, 
приводит к денатурации белков. Поэтому при проведении
электрофореза следует обеспечить охлаждение системы.

Электрофоретическая подвижность белка зависит:
– от самой молекулы: ее размера (молекулярной массы);
– формы, электрического заряда, степени диссоциации и гидратации;

– 
концентрации молекул;
– среды: ее вязкости, рН, температуры и ионной силы;
– характеристик используемого электрического поля.

1.2. Классификация электрофоретических методов

Основными типами электрофореза являются:
– зональный электрофорез;
– изоэлектрическое фокусирование;
– иммуноэлектрофорез.
Зональный электрофорез ведется при постоянном (неизме-

няющемся) значении рН буферного раствора, заполняющего дан-
ный носитель (бумагу, гель, др.). Исследуемый образец наносится
пятном или тонким слоем на носитель, по которому и перемеща-
ется в электрическом поле.

Усложненным вариантом зонального электрофореза является

диск-электрофорез (многофазный зональный электрофорез), при ко-
тором рН и другие характеристики, постоянные внутри одной «фа-
зы», при переходе к другой «фазе» скачкообразно изменяются.

При изоэлектрическом фокусировании в среде для электро-

фореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается
в зоне, где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI).
Для создания градиента рН обычно используют раствор полиами-
но-поликарбоновых кислот, которым насыщают носитель. В отсут-
ствии электрического поля эта смесь обычно имеет рН = 6,5. При на-
ложении электрического поля указанные кислоты обеспечивают
линейный градиент рН от 3 до 10.

Иммуноэлектрофорез сочетает в себе электрофоретическое

разделение белков с иммунопреципитацией, основанной на реак-
ции «антиген – антитело». Этот тип электрофореза превосходит
остальные по чувствительности и разрешающей способности.

По цели различают:
– аналитический электрофорез (для анализа состава смеси);
– препаративный электрофорез (для получения препаратов –

значительных количеств чистых веществ).

По степени денатурации разделяемых белков различают:
– нативный электрофорез;
– электрофорез в денатурирующих условиях.
В отличие от нативного электрофореза, электрофорез в денату-

рирующих условиях предполагает применение химических реаген-
тов, разрушающих пространственную структуру разделяемых белков.

По направлению фракционирования выделяют электрофорез,

при котором белки движутся в одном направлении, и двумерный
электрофорез, при котором сначала происходит разделение в одном
направлении, а затем – в направлении, перпендикулярном перво-
му. Двумерный электрофорез позволяет резко увеличить разрешаю-
щую способность при разделении смесей, состоящих из большого
количества разных белков.

В зависимости от ориентации носителя (геля, бумаги, др.)

электрофорез может быть вертикальным или горизонтальным.

Классификация по типу носителя жидкой фазы представлена 
в таблице. Первым был разработан электрофорез без какого-либо 
носителя: электрическая цепь между электродами замыкалась
через буферный раствор, в котором и происходило разделение белков. 
Позднее при электрофорезе начали применять носители жидкой 
фазы – полимеры, служащие «каркасом» для буфера. Применение 
носителей позволило заметно снизить конвекцию (перемешивание) 
и, следовательно, повысить качество разделения белков.
Носитель может быть в форме порошка, пленки, геля и др. Последующие 
разработки были посвящены усовершенствованию свойств
носителей.

Идеальный носитель должен:
а) резко снижать конвекцию;
б) быть простым в приготовлении;
в) иметь высокую теплопроводность (при низкой теплопроводности 
трудно охлаждать систему);

Низкая прозрачность, хрупкость, 
размер пор можно
менять лишь в небольших
пределах. Приготовление
качественного геля – трудоемкий 
процесс

Из-за отрицательного заряда 
на сульфатных и СООН-
группах сетки агара возникает 
электроосмос, приводящий 
к неравномерному
распределению электрического 
поля, а иногда –
гидростатического давления


На сегодняшний день наилучший 
носитель, но готовится 
из акриламида –
ядовитого вещества

Преимущества и недостатки использования различных носителей

при электрофорезе

Первый носитель со свойствами 
молекулярного сита. 
Активно препятствует
конвекции. Повышает разрешение


Удовлетворительная прозрачность, 
высокая пластичность (
проще резать,
удобнее красить и определять 
ферментативную активность 
прямо в геле),
простота изготовления

Химически инертен, можно 
кипятить. Можно задать 
необходимый размер
пор и обеспечить свойства
молекулярного сита. Высокая 
прозрачность. Легко
готовить. Упругий, прочный


Недостатки

Крахмальный гель
(предложен
О. Смитисом)

Агарозный гель

Полиакриламидный
гель – ПААГ
(предложен
Л. Орнстейном
и Д. Дэвисом)

Носитель
Преимущества

г) обладать низкой адсорбционной емкостью и химической

инертностью в отношении веществ, подвергаемых электрофорезу;

д) не иметь заряда на поверхности частиц, чтобы не вызывать

эндоэлектроосмос. Если разделяемые белки заряжены отрицательно, 
то при электрофорезе они должны двигаться к аноду (+), однако 
эндоэлектроосмос «тянет» их в другую сторону, к катоду (–),
мешая электрофоретическому разделению.

Гели легко принимают разные геометрические формы, поэтому 
в названии электрофоретического метода с их использованием