Книжная полка Сохранить
Размер шрифта:
А
А
А
|  Шрифт:
Arial
Times
|  Интервал:
Стандартный
Средний
Большой
|  Цвет сайта:
Ц
Ц
Ц
Ц
Ц

Научное приборостроение, 2022, том 32, № 2

научный журнал
Бесплатно
Основная коллекция
Артикул: 790579.0001.99
Научное приборостроение : научный журнал. - Санкт-Петербург : Институт аналитического приборостроения РАН, 2022. - Т. 32, № 2. - 84 с. - ISSN 2312-2951. - Текст : электронный. - URL: https://znanium.ru/catalog/product/1901308 (дата обращения: 29.03.2024)
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов. Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в ридер.
ISSN 0868–5886                                          НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2, c. 3–19 
 

 ПРИБОРОСТРОЕНИЕ  ДЛЯ  БИОЛОГИИ   

И  МЕДИЦИНЫ 

3 

 
УДК 543.07+577.213+681.2.08 
 
 А. Л. Буляница, Н. А. Есикова, А. А. Евстрапов, 2022 
 

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ  РЕЗУЛЬТАТОВ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО  

ГЕНЕТИЧЕСКОГО  АНАЛИЗА  НА  ОСНОВЕ  АППРОКСИМАЦИИ  

КИНЕТИЧЕСКОЙ  КРИВОЙ  ПОЛИМЕРАЗНОЙ  ЦЕПНОЙ  РЕАКЦИИ  

В  РЕАЛЬНОМ  ВРЕМЕНИ 

 

На полимерных микрофлюидных устройствах из поликарбоната и полипропилена реализована количественная 
полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Пороговый цикл определяется на основе 
точки перегиба функции логистического роста первого порядка, достоверно аппроксимирующей кривую 
ПЦР при отсутствии мешающих факторов, например наличия пузырей в реакционной камере. Использование 
статистических критериев (обобщенный критерий Стьюдента, однофакторный дисперсионный анализ) 
выявило незначимость влияния типа полимера на оценку положения порогового цикла при выбранном ранее 
алгоритме его поиска. При применении альтернативного алгоритма нахождения порогового цикла на основе 
построения касательной к кинетической кривой  в ряде случаев наблюдается значимое влияние типа полимера 
на оценку положения порогового цикла и, как следствие, на результат количественного анализа. Предложены 
и обсуждены алгоритмы обнаружения пузырей в реакционной камере на основе выявления разладки 
в последовательности измерений, связанные как с оценками параметров аппроксимирующей зависимости, 
так и с характеристиками временнóго ряда, сформированного погрешностями аппроксимации. 
 
 
Кл. сл.: полимеразная цепная реакция в реальном времени, кинетическая кривая, функция логистического 
роста первого порядка, оценка параметров, однофакторный анализ, восходящая и нисходящая серия,  
погрешность аппроксимации 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ 

Количественный генетический анализ, проводимый 
методом полимеразной цепной реакции  
в реальном времени (ПЦР-РВ), основывается на выявлении 
положения характерной точки кинетической 
кривой — порогового цикла. Наиболее часто 
в качестве порогового цикла используют либо 
временнóе положение точки перегиба кинетической 
кривой, либо временнóе положение точки 
пересечения касательной к кинетической кривой, 
проведенной в точке перегиба с горизонтальной 
прямой, задающей характерный уровень сигнала.  
Характерным уровнем может быть фоновый сигнал 
или нижняя граница сигнала, практически 
достоверно отличающегося от уровня фона. Возможны 
и другие варианты. 

Одной из задач работы является проверка возможности 
замены анализа непосредственно экспериментальных 
данных (кинетической кривой)  
на 
анализ 
аппроксимирующей 
зависимости  

и обоснованности применения в качестве последней 
функции логистического роста первого порядка. 
Выбор данной функции связан с тем, что она, 
во-первых, априорно удовлетворяет качественному 
виду кинетической кривой (относится к семейству 
сигмоидных функций) и, во-вторых, все ее 
три параметра имеют понятную содержательную 
интерпретацию. 

Основным оцениваемым параметром аппроксимирующей 
зависимости является временнóе положение 
ее точки перегиба, что необходимо для 
определения порогового цикла при использовании 
обоих вышеописанных алгоритмов. 

Второй задачей является выявление значимости 

влияния материала чипа — поликарбоната или 
полипропилена — на протекание ПЦР и на оценку 
положения 
порогового 
цикла 
применительно  

к различным анализируемым пробам, полученным 
путем различного разбавления исходной пробы. 
При этом данная задача решалась как для случая 
применения первого, так и для применения второго 
алгоритма поиска порогового цикла. 

Третья задача связана с выявлением наличия 

разладки в последовательности измерений, одной 
из причин которой являлось наличие пузырей  
в реакционной камере на протяжении нескольких, 
преимущественно от 3 до 7, циклов ПЦР. Выявление 
критериев присутствия пузырей, исходя из 
формы кинетической кривой, является практически 
важной задачей. Ее решение позволит сделать 
вывод о допустимости использования полученных 

А. Л. БУЛЯНИЦА, Н. А. ЕСИКОВА, А. А. ЕВСТРАПОВ 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

4

оценок положения порогового цикла и, как следствие, 
оценить правильность результатов количественного 
анализа. 

Предложенные и обсужденные далее критерии 

можно отнести к двум группам. Первая группа 
критериев базировалась на определении параметров 
аппроксимирующей функции, вторая —  
на оценке характеристик погрешностей аппроксимации. 


УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 

Были изготовлены микрочипы из поликарбоната 
Novattro (SafPlast, Россия) и полипропилена 
PP 4445S (ТУ 20.16.51-136-05766801-2015, ПАО 
Нижнекамскнефтехим, Россия) методом термо-
прессования в гидравлическом прессе MM-100 
(MTDI, Корея) на мастер-форме из нержавеющей 
стали, изготовленной методом лазерной микрооб-
работки. Для герметизации структур использовались "
Пленки для ПЦР плашек полимерные" Р-500 
(ООО "ПКФ Современные технологии"). Топология 
микрочипов представляет из себя 3 камеры  
с подводящими каналами (рис. 1) [1]. 

На микрочипах проведена ПЦР-РВ по обнаружению 
ДНК сои, выделенной вручную с использованием 
набора реагентов М-сорб-ООМ для выделения 
ДНК и РНК из клинических образцов  
и объектов окружающей среды. Постановка реакции 
проводилась для исходной концентрации выделенных 
нуклеиновых кислот, для разведений  
на 1, 2 и 3 порядка и для положительного контрольного 
образца используемого набора "Растение 
универсал" в трех повторах для каждого варианта. 
При работе с данным набором детектирование 
мишени проводится по красителю R6G, внутреннего 
положительного контроля — по Cy5. Все 
реагенты предоставлены ООО "Синтол" (Москва). 
Для сравнения аналогичные измерения проведены 
в пробирках  на АНК-48 (ИАП РАН, СПб). 

Измерения в микрочипах проводились на специально 
созданном макете, обеспечивающем режим 
термоциклирования для проведения ПЦР-РВ, 
возбуждение на длинах волн 530, 570 и 685 нм, 
регистрацию на 580, 630 и 660 нм соответственно. 
Зона детектирования представляла собой круг 
диаметром 3 мм. Камеры микрочипов заполнялись 
реакционной смесью с добавлением пробы ДНК, 
входы/выходы герметизировались ПЦР-пленкой. 
Микрочип размещался на нагревательном элементе 
пленкой вниз. 

Одним из существенных недостатков при постановке 
ПЦР в камере чипа по сравнению с пробирками 
является образование пузырьков газа при 
термоциклировании. Оно не оказывает заметного 
влияния на протекание реакции, однако препятствует 
проведению корректного оптического детектирования. 


АНАЛИЗ КИНЕТИЧЕСКИХ КРИВЫХ ПЦР 

Определение положения порогового цикла выполняется 
на основе поиска точки перегиба кривой 
ПЦР. Используется аппроксимирующая зависимость 
логистического роста первого порядка: 



0

.
1
exp
(
)

a
y
k x
x
 



 
 
(1)

 

Здесь а — максимальный сигнал (сигнал насыще-
ния); k — коэффициент, определяющий скорость 
увеличения сигнала, связанный с эффективностью 
ПЦР; х0 — точка перегиба кривой логистического 
роста первого порядка. Очевидно, что для норми-
рованного сигнала параметр а должен быть близок 
к 1. 

Значимость зависимости положения порогово-

го цикла от материала микрочипа — поликарбона-
та (pc) и полипропилена (рр) — определяется из-
вестными статистическими методами. 

1. Обобщенный критерий Стьюдента позволя-

ет дать оценку однородности положения порого-
вого цикла для двух выборок, соответствующих 
различным материалам. 

2. Степень влияния материала на положение 

порогового цикла также выявляется с помощью 
однофакторного дисперсионного анализа. 

Объемы выборок (число повторений экспери-

ментов) малы (как правило, 3 повтора). 

 
Рис. 1. Изображение микрочипов. 
Верхний — из полипропилена, нижний — из поли-
карбоната 

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ  РЕЗУЛЬТАТОВ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО  ГЕНЕТИЧЕСКОГО  АНАЛИЗА 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

5

Метод одно- или многофакторного анализа хо-

рошо известен [2]. Однако его используют до сих 
пор, в том числе и в различных прикладных зада-
чах, например, см.  [3, 4]. Поскольку даже двух-
факторный анализ мы не использовали, то под 
термином "факторный анализ" полагаем однофак-
торный анализ. Расчетные формулы и необходи-
мые критерии обсуждаются в [2]. 

Обозначения пробы: материал полимера опре-

деляет буквенную часть — pc или pp, цифра 1, 2 
или 3 задает степень разбавления исходной пробы 
на 1, 2 или 3 порядка, т.е. в 10, 100 или 1000 раз 
соответственно (символ с на месте цифры — не-
разбавленная проба).  

Проба vpk, или ВПК, представляет собой внут-

ренний положительный контроль.  Положение по-
рогового цикла, смещенное более чем на 7 циклов 
по отношению к пороговому циклу данной пробы, 
свидетельствует об отсутствии анализируемого 
генетического материала. В табл. 1 представлены 
результаты определения положения порогового цик-
ла в пробе внутреннего положительного контроля. 

Динамика оценок порогового цикла при ис-

пользовании различных наборов измерений сигна-
ла пробы внутреннего положительного контроля 
иллюстрируется данными табл. 2. Оценка положе-
ния порогового цикла при использовании всей вы-
борки 28.15 ±0.04 цикла. 

Практически все оценки положения порогового 

цикла, за исключением сделанных по отсчетам 1–
25, имеют приемлемую точность с отклонением 
средней оценки в пределах нескольких сотых цик-
ла. Принципиально важным является попадание 
точки перегиба кривой в диапазон выбранных от-
счетов сигнала. 

Диапазон 1–30 содержит лишь 2 измерения по-

сле точки перегиба, и точность оценивания ниже. 
В остальных случаях оценки положения точки пе-
региба сопоставимы по точности. Оценка точки 
перегиба осуществлялась по аппроксимирующей 
кривой логистического роста первого порядка  
во всех случаях. При этом при всех вариантах рас-
чета, кроме первых двух, точка перегиба кинети-
ческой кривой являлась внутренней точкой, уда-
ленной от границ временнóго интервала (цикл 1,  
цикл 40) по крайне мере на 20%-ю часть от длины 
интервала. Для интервала 1–35 положение порого-
вого цикла 28.09 отстоит от верхней границы  
примерно  на 7 циклов при полной ширине интер-
вала 34 цикла.  

Далее в табл. 3 представлены данные расположе-

ния точки перегиба кинетической кривой для исход-
ной пробы, разбавленной на 1 порядок (в 10 раз),  
при использовании микрофлюидных чипов из раз-
личных полимерных материалов. 

 
 

 
 

Табл. 1. Расчетные данные по положению порогового цикла 

 

№ п/п
Pc_vpk
Pp_vpk

1
28.15 ±0.04
27.68 ±0.05

2
28.15 ±0.04
28.19 ±0.04

3
28.24 ±0.04
28.54 ±0.03

Среднее
28.18
28.14

 
 
 

Табл. 2. Оценки положения порогового цикла в зависимости от выбора 
отсчетов информативного сигнала 

 

Диапазон 
отсчетов 

Пороговый

цикл 

Диапазон 
отсчетов 

Пороговый

цикл 

1–25
45.66
1–40
28.10 ±0.04

1–30
28.28 ±0.24
5–40
28.10 ±0.04

1–35
28.09 ±0.06
10–40
28.10 ±0.04

1–50
28.15 ±0.04
15–40
28.10 ±0.03

 
 
 
 

А. Л. БУЛЯНИЦА, Н. А. ЕСИКОВА, А. А. ЕВСТРАПОВ 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

6

Табл. 3. Оценки положения точки перегиба кинетической кривой  
при использовании устройств из  различных полимерных материалов 

 

№ п/п
Pc_1
Pp_1

1
25.40 ±0.04
25.42 ±0.02

2
25.55 ±0.04
25.31 ±0.12

3
25.52 ±0.03
26.18 ±0.02

Среднее
25.49
25.64

 
 

Табл. 4. Положения точек перегиба кинетических кривых  
для разных разведений пробы 

 

№ п/п
Pc_с
Pp_с

1
22.00 ±0.03
22.02 ±0.05

2
21.88 ±0.03
22.02 ±0.15

Среднее
21.94
22.02

№ п/п 
Pc_2 
Pp_2 

1
28.22 ±0.04
30.31 ±0.48

2
28.61 ±0.04
29.20 ±0.36

3
28.15 ±0.04
29.97 ±0.11

Среднее
28.33
29.83*

№ п/п 
Pc_3 
Pp_3 

1
31.48 ±0.06
31.12 ±0.03

2
31.71 ±0.03
31.36 ±0.03

3
–
31.75 ±0.04

Среднее
31.59
31.41

 
                                     Примечание: *недостоверно из-за наличия пузырей (экспертная оценка). 
 
 

 
Положение порогового цикла полагаем совпа-

дающим с координатой точки перегиба кинетиче-
ской кривой. Мы искали точку перегиба аппрок-
симирующей зависимости (1). Использование 
процедуры однофакторного дисперсионного ана-
лиза позволяет вычислить характерное значение 
случайной величины F — отношение двух диспер-
сий, связанных с расхождением средних оценок  
и дисперсией измерений внутри выборки, соответ-
ствующей каждому фактору, удовлетворяющей 
распределению Фишера с 1 и 4 степенями свобо-
ды, исходя из двух градаций фактора (два полиме-
ра) и суммарного числа 6 измерений. Этой вели-
чине F, примерно равной 0.291, соответствует до-
верительная вероятность 60%. Это значит, что  
с такой вероятностью расхождение элементов вы-
борок (значений оценок порогового цикла) не мо-
жет объясняться влиянием полимера. 

Схожие результаты с вероятностями порядка 

50% наблюдаются и для оценок порогового цикла 
при разбавлениях на 3 порядка (F около 0.534).  
В табл. 4 приведены данные положений точек пе-
региба кинетических кривых, соответствующих 
другим разведениям исходной пробы. 

Вышеуказанные значения также, в соответст-

вии с методикой однофакторного дисперсионного 
анализа, свидетельствуют о независимости поло-
жения порогового цикла от выбора материала при 
заданном разведении пробы. Правда, уровень зна-
чимости не превышает 50%. Сопоставление поло-
жений порогового цикла для проб с разбавлением 
на 2 порядка не проводилось, поскольку на поли-
пропиленовых чипах были выявлены пузыри. 

Далее на рис. 2 и 3 проиллюстрировано распре-

деление параметров аппроксимации a и k приме-
нительно к различным кинетическим кривым 
ПЦР-РВ.  

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ  РЕЗУЛЬТАТОВ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО  ГЕНЕТИЧЕСКОГО  АНАЛИЗА 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

7

 

 

 
 
 

 

 

 
Изначально сигнал нормирован и приведен  

к диапазону [0;1]. Нулю соответствует наимень-
шая величина сигнала, единице — наибольшая. 

Таким образом, границы диапазона определяются 
по локальным минимумам и максимумам сигнала 
без его предварительной обработки. 

a

Рис. 2. Распределение оценок 
параметра а зависимости (1) 
 

Рис. 3. Зависимость распреде-
ления параметра k модели (1) 

k

А. Л. БУЛЯНИЦА, Н. А. ЕСИКОВА, А. А. ЕВСТРАПОВ 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

8

ФОРМИРОВАНИЕ И ОБСУЖДЕНИЕ  
КРИТЕРИЕВ НАЛИЧИЯ ПУЗЫРЕЙ  

В РЕАКЦИОННОЙ КАМЕРЕ 

Очевидно, что наличие пузыря влияет на форму 

кинетической кривой. Изменение формы сигнала 
или/и скачкообразное изменение его параметров 
при сохранении вида зависимости относятся  
к двум типам разладки в последовательности измерений. 
Выявление разладки основывается либо 
на оценке параметров аппроксимирующей зависимости (
1) с учетом их физического смысла (роли), 
либо на оценке погрешности аппроксимации. 
При этом принято допущение, что собственно погрешность 
аппроксимации пренебрежимо мала,  
а после компенсации аппроксимирующей детерминированной 

составляющей 
информативного 

сигнала погрешность носит случайный характер. 
Тогда эта погрешность анализируется на наличие/
отсутствие детерминированных составляющих 
(трендов). 

Предложенные и обсужденные далее критерии 

отсутствия пузырей и, как следствие, доверия  
к полученным результатам анализа основываются 
на попадании параметров детерминированной зависимости (
1) в диапазон, соответствующий физически 
обоснованным значениям. В то же время 
группа критериев, связанная с оценкой параметров 
помехи, базируется на статистических оценках 
выборки с отсутствием трендов.   

В настоящий момент наличие пузыря и его 

влияние на форму и параметры кинетической кри-
вой требует исключения соответствующего ре-
зультата анализа как недостоверного. Во многих 
случаях степень искажения теоретически обосно-
ванной формы сигнала пробы как сигмоидной 
функции определяется исключительно на основе 
субъективной оценки.  

Согласно экспертным оценкам, измерения 1–17 

соответствуют отсутствию пузырей, 18–27 — на-
личие пузыря(ей). 

На графике (рис. 2) выделена горизонтальная 

область допустимых значений параметра а при 
максимальном уровне нормированного сигнала 1. 
Теоретически оценка этого параметра должна сов-
падать с максимумом сигнала, он же уровень на-
сыщения. 

Жирными горизонтальными прямыми выделе-

на область 0.95–1, в которой может находиться 
оценка параметра а при достаточно большом от-
ношении сигнал/шум. 

Отношение сигнал/шум для рассматриваемых 

нормированных сигналов пробы при условии кор-
ректной компенсации фонового сигнала и отсутст-
вии статистических выбросов находится в диапа-
зоне (50–60) к 1. При этом в качестве характерного 
значения сигнала рассматривается его среднее 

значение, примерно равное 0.5, а в качестве мас-
штаба шума берется среднеквадратичное отклоне-
ние погрешности аппроксимации. 

Первые 17 измерений, характеризующиеся от-

сутствием пузырей, полностью попадают в ука-
занную область. При этом из 10 измерений с при-
сутствием пузырей в данный интервал попадает 
лишь 3 значения из 10. Аналогичные результаты 
будут получены при повышении нижней границы 
области допустимых значений параметра а до зна-
чения 0.96. 

Связь между средней эффективностью ПЦР Е  

и параметром уравнения k имеет вид: 

exp( ) 1.
E
k

  

Поскольку теоретически обоснованное значе-

ние эффективности ПЦР не может превышать 1 
(или 100%), то ожидаемое значение параметра k  
в аппроксимирующем уравнении не должно пре-
вышать 0.693.

 

На рис. 3 горизонтальные прямые соответству-

ют теоретически обоснованным значениям сред-
ней эффективности ПЦР 80% (нижняя прямая со 
значением 0.588) и 100% (верхняя прямая со зна-
чением 0.693). Из 17 измерений при отсутствии 
пузырей 12 достоверно попадают в указанную область, 
5 находятся вне ее (2 из этих 5 измерений 
практически позиционируются на границе допустимых 
значений). При этом из 10 измерений с пузырями 
в данном диапазоне нет ни одного результата (
1 практически попадает на границу, а остальные 
9 достоверно вне области). 

Комбинация этих ограничений позволяет выявить 
подозрительные с точки зрения наличия пузырей 
экспериментальные данные. 

В некоторых алгоритмах параметр модели (1) 

х0 — абсцисса точки перегиба определяет положение 
порогового цикла. Другим алгоритмом определения 
порогового цикла является поиск абсциссы 
точки пересечения касательной, проведенной  
в точке перегиба ПЦР-кривой, с осью ординат. 

Если в аппроксимации (1) параметр a близок 1, 

то при использовании второго  алгоритма положение 
порогового цикла смещено относительно х0  
и примерно равно 
0
2 /
x
k

.  

Другие методы поиска параметров зависимости 

(1) используют не всю выборку (данные по всем 
циклам 1–40 или 1–50 циклам), а только набор отдельных 
элементов. Например, ранее в работе [5] 
была предложена оценочная формула для величины  

1
exp( )
С
E
k
 

. Однако очевидно, что пред-

ложенная в этой работе четырехточечная формула, 
использующая измерения сигнала в двух парах 
равноотстоящих друг от друга отсчетах, условно 
нумерованных как  

n, n + k, n + m  и  n + m + k, 

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ  РЕЗУЛЬТАТОВ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО  ГЕНЕТИЧЕСКОГО  АНАЛИЗА 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

9

 
 

    

 

 
 
 
 
 

 

заведомо дает более грубую оценку, чем аппрок-
симирующая зависимость, которая использует всю 
выборку измерений, как правило, 40–50. 

Также оценка положения точки перегиба кри-

вой может быть выполнена МНК при построении 
полинома 3-й степени, аналитического вычисле-
ния производной второго порядка, приравнивания 
ее к нулю и нахождения корня решением линейно-
го уравнения. Этот прием был использован при 
поиске точки перегиба кривой плавления ДНК [6]. 
Подтверждена ожидаемая закономерность: более 
точные оценки получаются при использовании 
отсчетов с линейного участка кривой со значения-
ми нормированного сигнала, близкими к 0.5. При 
этом лучше брать не ровно 4 точки, а объем вы-
борки должен иметь несколько степеней свободы 
(не менее 6–8 отсчетов). 

Например, для кинетической кривой оценка 

точки перегиба 25.55 (см. табл. 3, строку 2). Поли-

номиальная аппроксимация кубической параболой 
по отсчетам 22–27 дает оценку точки перегиба 
25.79, что приемлемо для примерного расчета. 
Здесь приведены типичные зависимости нормиро-
ванных сигналов пробы и рассеяния при отсутст-
вии пузырей (рис. 4) и при наличии одного пузыря 
(рис. 5). 

Кривая, 
соответствующая 
нормированному 

сигналу рассеяния (см. рис. 4 и 5), может быть 
адекватно аппроксимирована полиномом второй 
степени.  

Положение порогового цикла, как указано ра-

нее, может определяться с помощью двух алгорит-
мов. Для исходной пробы, разбавленной в 10 раз 
(на 1 порядок), в табл. 5 приведены данные оценок 
положения порогового цикла при анализе на чипах 
из различных полимерных материалов.  

 

 

Табл. 5. Расчетные данные по положению порогового цикла в зависимости от метода 
его поиска 
 

№ п/п 
Точка перегиба 
Касательная 

Pc_1 
Pp_1 
Pс_1 
Pp_1 

1
25.40
25.42
22.13
22.36

2
25.55
25.31
22.09
22.57

3
25.52
26.18
22.23
22.75

среднее
25.49
25.64
22.15
22.56

 

Рис. 4. Нормированные сигналы пробы и рассеяния 
при отсутствии пузырей (из группы рс_1) 

Рис. 5. Нормированные сигналы пробы и рассеяния 
при наличии пузыря на заключительной стадии 
(рр_1) 

А. Л. БУЛЯНИЦА, Н. А. ЕСИКОВА, А. А. ЕВСТРАПОВ 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

10

 
Данные табл. 5 свидетельствуют о том, что при 

оценке положения порогового цикла с использо-
ванием построения касательной к кинетической 
кривой в точке перегиба на основе однофакторно-
го анализа получаем отношение приведенных 
дисперсий F примерно 11.65. Вывод: с вероятно-
стью 97% различие положений порогового цикла 
при использовании точки пересечения касатель-
ной к перегибу кривой и оси ординат объясняется 
именно различием материала (поликарбонат или 
полипропилен). Для алгоритма поиска порогового 
цикла непосредственно в точке перегиба вывод 
противоположен: с большой вероятностью фактор 
выбора материала на положение порогового цикла 
не влияет. 

Другая группа алгоритмов выявления присут-

ствия пузыря может основываться на статистиче-
ском критерии восходящих и нисходящих серий 
погрешности аппроксимации сигналов пробы или 
рассеяния при достижении высокой достоверности 
детерминации (коэффициент детерминации заве-
домо должен превышать 0.9). Один из таких кри-
териев имеет значимость 5% и требует удовлетво-
рения числом восходящих и нисходящих серий 
двух условий. При общем числе отсчетов (по-
грешностей аппроксимации), равном N: 

*

max

2
1
16
29
(
)
1.96
,
3
90

(
)
(
),

N
N
ser N

N
N






















 
(2)

 

 

*

5
26,

(
)
6
26
153,

7
153
1170.

N

N
N
N














 

 
 
(3)

 

 
Формула (2) базируется на данных [7, c. 486–

488], а ограничения (3) обсуждаются в [8]. Приме-
нительно к оценкам информативного сигнала 
(сигнал пробы) на рис. 4 и 5 объем исходных вы-
борок был 40 отсчетов. Так как для оценки нали-
чия восходящей или нисходящей серий требова-
лось построить правую разность первого порядка, 
то объем рассматриваемой выборки разностной 
погрешности N равен 39. Соответственно, восхо-
дящая серия содержит последовательность поло-
жительных значений разностной погрешности, 
нисходящая — отрицательные. Согласно первому 
условию (2), число серий ser(N) должно быть бо-
лее 20, согласно второму условию (3), наибольшая 
длина серии должна быть строго меньше 6, т.е. не 
более 5. 

Наблюдаются следующие тенденции: кривой 

пробы на  рис. 4 соответствует число серий 23  
и максимальная длина серии 4. Таким образом, 

оба условия (2) и (3) выполнены. Применительно  
к кривой пробы рис. 5: число серий 19, макси-
мальная длина серии 5. Условие (2) нарушено, ус-
ловие (3) выполнено. 

Аналогичные данные по кривым рассеяния по-

сле компенсации детерминированной составляю-
щей — полинома второй степени применительно  
к рис. 4: число серий 29, максимальная по длине 
серия 3; применительно к рис. 5: число серий 19, 
максимальная по длине серия 6. 

Если в первом случае (рис. 4) оба условия так-

же выполнены, а это случай отсутствия пузырей, 
то во втором случае (рис. 5) нарушены оба усло-
вия. 

Ответ на вопрос, насколько данные критерии 

присутствия пузырей универсальны, может явить-
ся предметом дальнейшего исследования на осно-
ве более репрезентативной статистики. Еще один 
из критериев можно связать с анализом распреде-
ления восходящих или нисходящих фаз (серий)  
по длине и с расхождением с теоретическими 
оценками математического ожидания числа серий 
заданной длины при отсутствии в выборке трен-
дов. 

Математическое ожидание числа серий длины 

d (d = 1, 2, 3, …) [7] представлено далее формулой 
(4): 

2
2(
2)(
3
1).
(
3)!

d

N
d
d
d
N
d







 
 
(4) 

При числе отсчетов 39 математические ожида-

ния числа восходящих или нисходящих серий 
длин 1, 2, …, 5 равны соответственно 15.00, 6.42, 
1.79, 0.38 и 0.07.  

Близость реального распределения серий к тео-

ретически обоснованному оценивается с исполь-
зованием критерия согласия Пирсона (или Хи-
квадрат) со следующими поправками и допуще-
ниями: а) рассматриваются только три значения — 
числа серий длины 1, длины 2 и длины 3 или бо-
лее; б) найденной величине присваивается число 
степеней свободы 2.5, если она равна 6.3 или бо-
лее, либо 2 степени свободы при меньших значе-
ниях характеристики расхождения. Во втором 
случае вводится уменьшающий поправочный ко-
эффициент 6/7. Эта классическая методика сфор-
мулирована в работе [9]. Особенности распреде-
лений фаз по длинам для случаев наличия или от-
сутствия пузырей иллюстрируются в табл. 6.  

Соответственно рассматриваются процентная 

точка распределения Хи-квадрат с 2 степенями 
свободы и ее процентные точки [10].  

Если уровень вероятности согласия с гипотезой 

менее 10%, то ее следует отвергать. Следовательно, 

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ  РЕЗУЛЬТАТОВ  КОЛИЧЕСТВЕННОГО  ГЕНЕТИЧЕСКОГО  АНАЛИЗА 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

11

 
 

Табл. 6. Распределение восходящих и нисходящих фаз по длинам для различных особенностей проведения 
ПЦР-РВ 
 

Число фаз  

(серий) 

Теория 

(4) 

Проба,  
рис. 4 

Рассеяние, 

рис. 4 

Проба,  
рис. 5 

Рассеяние, 

 рис. 5 

d = 1 
15.00 
12 
22 
10 
9 

d = 2 
6.42 
7 
4 
4 
5 

d = 3
1.79 
3 
3 
1 
2 

d = 4
0.38 
1 
0 
2 
2 

d = 5
0.07 
0 
0 
2 
0 

d = 6
0.01 
0 
0 
0 
1 

Хи-квадрат* 
1.64 
3.77 
4.93 
5.04 

Вероятность** 
44 
16 
9 
8 

 
Примечание: *введен поправочный коэффициент 6/7 [9], а данные по d = 3, 4, 5 и 6 просуммированы; 

                           **вероятность округлена до целых процентов. 

 
 
 

гипотеза об отсутствии трендов (разладок) после 
компенсации аппроксимирующей детерминиро-
ванной составляющей сигнала при наличии пузы-
рей (группа данных рис. 5) должна быть отвергну-
та. Указанная гипотеза применительно к информа-
тивному сигналу пробы при отсутствии пузырей 
принимается с высоким уровнем значимости (бо-
лее 40%), что является достаточным для принятия 
гипотезы об отсутствии трендов в последователь-
ности погрешностей аппроксимации и, как следст-
вие, отсутствии разладки в последовательности 
исходных измерений. 

Следовательно, предложенные алгоритмы при-

нятия решений о наличии пузырей, как связанные  
с анализом информативного сигнала, так и с по-
грешностью аппроксимации, с большой вероятно-
стью позволяют делать правильные выводы. Од-
нако насколько полученные результаты специ-
фичны по отношению к выбранному объекту ана-
лиза и в какой степени допускают обобщение  
на другие объекты, требует дополнительного ис-
следования. 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

Проведенные серии количественного генетиче-

ского анализа на основе ПЦР-РВ с использовани-
ем полимерных чипов выявили следующие зако-
номерности: при определении порогового цикла 
как точки перегиба кинетической кривой (логи-
стическая кривая первого порядка) отсутствует 
значимая зависимость найденных величин от ма-
териала чипа (поликарбонат или полипропилен).  

В то же время, если оценивать положение порого-
вого цикла по абсциссе точки пересечения каса-
тельной к кинетической кривой, построенной  
в точке ее перегиба, с уровнем фонового (мини-
мального) сигнала, с доверительной вероятностью 
более 90% фактор материала полимера на положе-
ние порогового цикла влияет. 

Информативный сигнал (сигнал пробы) при от-

сутствии пузырей с высокой точностью аппрокси-
мируется логистической кривой первого порядка — 
одним из типов сигмоидной кривой. При этом коэффициент 
детерминации превышает 0.99. Также 
в данных условиях при нормализации сигнала 
пробы отношение сигнал/шум достигает значений 
55–60. Под масштабом (характерной величиной) 
сигнала понимается среднее значение, под масштабом 
шума — среднеквадратичное отклонение 
погрешности аппроксимации. 

Проверка критериев наличия пузырей для нормированной 
кинетической кривой: 

а) коэффициент а в аппроксимирующей зависимости 
существенно ниже 1; 

б) нефизическое значение коэффициента k, достоверно 
превышающее значение 0.70 или существенно 
меньшее 0.58; 

в) на основе анализа восходящих и нисходящих 

серий в последовательности измерений погрешностей 
аппроксимации наблюдается невыполнение 
одного или двух условий отсутствия трендов,  
а также существенное отклонение длин восходящих 
и нисходящих серий (фаз) от теоретически 
обоснованных при отсутствии трендов распределения.  


А. Л. БУЛЯНИЦА, Н. А. ЕСИКОВА, А. А. ЕВСТРАПОВ 

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2022, том 32, № 2 

12

Комбинация предложенных критериев после 

дополнительной проверки их универсальности 
(правомерности обобщения на другие биологиче-
ские объекты или/и другие материалы чипа) мо-
жет быть включена в программно-математическое 
обеспечение приборов, что в перспективе исклю-
чит участие субъективного фактора (эксперта) при 
принятии решения о присутствии пузырей в реак-
ционной камере на какой-либо стадии построения 
кинетической кривой. 

Работа выполнена в рамках Государственного за-

дания Министерства науки и высшего образования 
Российской Федерации № 075-00761-22-00 (тема 
"Микрофлюидные устройства с интегрированными 
функциональными микро- и наноразмерными структу-
рами для биологических и медицинских исследований", 
FFZM-2022-0012). 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 

1. Есикова Н.А., Гермаш Н.Н., Евстрапов А.А.  Опера-

тивное изготовление микрочипов для ПЦР-анализа из 
полимерных материалов в лабораторных условиях // 
Научное приборостроение. 2020. Т. 30, № 4. С. 21–26. 
URL: http://iairas.ru/mag/2020/abst4.php#abst2 

2. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая 

статистика: учебное 
пособие 
для 
инженерно-

экономических институтов и факультетов. Изд. 4-е, 
доп. М.: Высшая школа, 1972. 367 с. 

3. Тихомиров Н.П., Тихомирова Т.М.,  Ушмаев О.С. Ме-

тоды эконометрики и многомерного статистического 
анализа: учебник.  М.: Экономика, 2011. 637 с.  

4. Плохотников К.Э., Колков С.В. Статистика: учебное 

пособие. М.: Флинта, 2006. 286 с.  

5. Буляница А.Л. Методы оценивания параметров кривой 

логистического роста.  Ч. 1. Оптимизация условий 

оценивания при наличии аддитивной случайной по-
мехи  // Научное приборостроение.  2009.  Т. 19, № 3. 
С. 3–11.  URL: http://iairas.ru/mag/2009/abst3.php#abst1 

6. Белов Д.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Новая методика 

обработки  флуоресцентного  отклика  плавления 
ДНК // Научное приборостроение. 2018. Т. 28, № 1. 
С. 3–10. URL: http://iairas.ru/mag/2018/abst1.php#abst1 

7. Кендалл М.Дж., Стьюарт А.  Многомерный стати-

стический анализ и временные ряды. М.: Наука, 1976. 
736 c. 

8. Критерий "восходящих" и "нисходящих" серий. URL: 

https://math.semestr.ru/trend/series.php (дата обращения: 
19.04.2022) 

9. Wallis W.A., Moore G.H. A significance test for time se-

ries analysis // J. Amer. Statist. Ass. 1941. Vol. 36, 
is. 215. P. 401–409. URL:  
https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/01621459.1
941.10500577 

10. Большев Л.Н., Смирнов Н.В. Таблицы математической 

статистики. М.: Наука, 1983. 416 с. 
 
 
 
 
 
 

Институт аналитического приборостроения РАН,   
Санкт-Петербург 

 

Контакты: Буляница Антон Леонидович, 
antbulyan@yandex.ru 
 
 
Материал поступил в редакцию 29.04.2022