Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования

«Казанский национальный исследовательский

технологический университет»

Ю. В. Щербакова, Ф. Ю. Ахмадуллина, Е. А. Егорова 

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 
МЕТОДА ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКОЙ 

КУЛОНОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ 

ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ 

АКТИВНОСТИ МОЛОКА 

И КИСЛОМОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ

Монография

Казань

Издательство КНИТУ

2019

УДК 137.1:543
ББК 36.95:Г46

Щ61

Печатается по решению редакционно-издательского совета 

Казанского национального исследовательского технологического университета

Рецензенты:

д-р биол. наук, ст. науч. сотр. А. Б. Выштакалюк

канд. биол. наук, доц. А. Р. Каюмов

Щ61

Щербакова Ю. В.
Перспективы использования метода гальваностатической кулоно-
метрии для оценки интегральной антиоксидантной активности мо-
лока и кисломолочной продукции : монография / Ю. В. Щербакова, 
Ф. Ю. Ахмадуллина, Е. А. Егорова; Минобрнауки России, Казан. 
нац. исслед. технол. ун-т. – Казань : Изд-во КНИТУ, 2019. – 128 с.

ISBN 978-5-7882-2789-4

Обобщены и систематизированы данные по антиоксидантной системе 

молока, включающей соединения различной природы, и механизмам их дей-
ствия, а также представлена информация о методах определения интегральной 
антиоксидантной активности в сравнительном аспекте. Приведены методика 
выполнения измерений интегральной антиоксидантной активности на основе 
метода гальваностатической кулонометрии и полученные на ее основе экспе-
риментальные данные для молочного сырья казеинового типа и кисломолоч-
ной продукции. Предложены рекомендации по реализации данного метода 
в производственных условиях. 

Предназначена студентам, аспирантам и специалистам ряда отраслей 

пищевой промышленности, разработчикам новых видов молочной продукции, 
в том числе продуктов функционального назначения, а также широкой ауди-
тории читателей, отдающих предпочтение здоровому типу питания.

Подготовлена на кафедре промышленной биотехнологии.

ISBN 978-5-7882-2789-4
© Щербакова Ю. В., Ахмадуллина Ф. Ю., 

Егорова Е. А., 2019

© Казанский национальный исследовательский 

технологический университет, 2019

УДК 137.1:543
ББК 36.95:Г46

С О Д Е Р Ж А Н И Е

Введение ................................................................................................................. 4
Глава 1. СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ  ОКИСЛЕНИЕ И АНТИОКСИДАНТЫ............ 6
Глава 2. АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА  МОЛОКА............................................ 13
2.1. Антиоксиданты белковой природы ............................................................. 13

2.1.1. Казеиновая фракция молока ............................................................ 14
2.1.2. Сывороточные белки......................................................................... 15
2.1.3. Ферменты ........................................................................................... 21

2.2. Витамины — компоненты  антиоксидантной системы молока................. 32

2.2.1. Провитамины ..................................................................................... 32
2.2.2. Жирорастворимые витамины........................................................... 35
2.2.3. Водорастворимые витамины............................................................ 40
2.2.4. Витаминоподобные вещества .......................................................... 46

2.3. Низкомолекулярные компоненты  антиоксидантной защитной 
системы молока.................................................................................................... 50
2.4. Гормоны ......................................................................................................... 58
Глава 3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ  АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ:  
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ................................................................................... 62
3.1. Люминесцентный анализ ............................................................................. 64
3.2. Фотометрические методы ............................................................................ 71
3.3. Электрохимические методы......................................................................... 77
Глава 4. ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКАЯ  КУЛОНОМЕТРИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ 
ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОКА 
И МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ................................................................................. 91
4.1. Методика определения интегральной  антиоксидантной 
активности молочной  продукции и рекомендации по реализации 
метода в производственных условиях ............................................................... 91
4.2. Экспериментальное подтверждение  перспективности применения 
метода  кулонометрического титрования  электрогенерированным 
бромом на практике............................................................................................. 95

4.2.1. Стадия приемки молока.................................................................... 95
4.2.2. Стадия пастеризации молока ........................................................... 97
4.2.3. Сравнительный мониторинг качества  кисломолочных 
продуктов различных  производителей .................................................... 99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 103

В В Е Д Е Н И Е

Неблагоприятная экологическая обстановка, напряженный жиз-

ненный ритм, высокие психоэмоциональные нагрузки в современных 
условиях – основные причины резкого всплеска заболеваний, обуслов-
ливающих активное стремление человека улучшить свое здоровье и 
укрепить иммунную систему. Учитывая свободнорадикальный меха-
низм большинства патологий [1, 2], к ключевым проблемам сегодняш-
него дня следует отнести разработку и расширение ассортимента про-
дуктов здорового питания, обладающих антиоксидантными свой-
ствами, позволяющими сохранить необходимый баланс между свобод-
ными радикалами и антиокислителями иммунной системы и обеспе-
чить нормальное функционирование организма человека.

Продукты здорового питания, или функциональные продукты, 

являясь продуктами естественного происхождения [3, 4] способны при 
систематическом употреблении оказывать регулирующее действие на 
организм из-за повышения его устойчивости к воздействию неблаго-
приятных факторов окружающей среды, а также общеукрепляющих 
свойств и, как следствие, предупредить болезни и преждевременное 
старение человека в сложившейся среде обитания. Поэтому сохранение 
здоровья населения, в том числе опосредованно через пищевые про-
дукты функционального назначения, – приоритетное направление гос-
ударственной политики РФ.

Отечественные разработчики [5] выделяют три категории про-

дуктов функционального питания:

1. Традиционные продукты, содержащие в нативном виде значи-

тельное количество антиоксидантов различной природы, что, в первую 
очередь, касается молока и молочной продукции.

2. Традиционные продукты, в которых снижено содержание 

вредных для здоровья компонентов, например гидрогенизированного 
масла и др.

3. Продукты, обогащенные биологически активными веще-

ствами, включая антиоксиданты.

Однако объем информации об ингредиентах продуктов питания, 

доступный для потребителей, явно недостаточен ввиду отсутствия дан-
ных по их физиологическому воздействию. Поэтому изучение антиок-
сидантной активности – важнейшая задача при разработке продуктов 
питания функционального назначения, включая лечебно-профилакти-
ческие.

В связи с этим возникает необходимость достоверно контролиро-

вать антиоксидантную активность пищевых продуктов и ее изменение 
как при переработке сельскохозяйственного сырья, так и при хранении 
продукции, которая может претендовать на роль современного каче-
ственного показателя [6]. Но многообразие и полифункциональный ха-
рактер антиокислителей природных сырьевых источников, роль кото-
рых может существенно различаться в разных условиях активации сво-
бодно-радикальных процессов, и невозможность их отдельного опре-
деления из-за недостаточного развития инструментально-аналитиче-
ской базы диктуют необходимость изыскания и разработки методов 
определения интегральной антиоксидантной активности пищевой про-
дукции и в особенности молочной и кисломолочной, содержащей боль-
шой природный комплекс биологически активных веществ, проявляю-
щих антиокислительные свойства [7, 8]. 

Разработанные на сегодняшний день методики определения ан-

тиоксидантной активности (фотометрические, люминесцентные, элек-
трохимические методы) отличаются различной степенью интегрально-
сти, и информация в этой области имеет разобщенный характер. По-
этому очевидна актуальность исследований в области изучения, обоб-
щения и систематизации данных по антиокислительным свойствам мо-
лочного сырья и влияния на компоненты антиоксидантной системы мо-
лока различных факторов, а также скрининга перспективных методов 
определения интегральной антиоксидантной активности и оценки 
уровня их применимости в молочной промышленности.

Г л а в а  1 .  С В О Б О Д Н О - Р А Д И К А Л Ь Н О Е  

О К И С Л Е Н И Е  И  А Н Т И О К С И Д А Н Т Ы

Основная причина патологических процессов в организме чело-

века, вызывающих преждевременное старение и развитие многих бо-
лезней, – избыточное накопление в организме активных форм кисло-
рода [9, 10], представляющих собой в основном свободные радикалы. 
Под свободными радикалами понимают молекулу или ее часть, имею-
щую неспаренный электрон на молекулярной или на внешней (валент-
ной) атомной орбитали, что свидетельствует о наличии у молекулы сво-
бодной валентности.

Свободный радикал (СР) с одним неспаренным электроном назы-

вается монорадикалом, а с двумя – бирадикалом, причем число неспа-
ренных электронов соответствует числу свободных валентных связей. 
Радикал может нести электрический заряд, и тогда его называют ион-
радикалом. Это происходит при одноэлектронных окислительно-вос-
становительных реакциях, когда образуются анион- или катион-ради-
калы [11]. Для СР характерна большая реакционная способность по от-
ношению ко многим нейтральным молекулам.

Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически ак-

тивных молекул, производных молекулярного кислорода, являющихся 
нормальными метаболитами, и рассматриваются в настоящее время 
многими авторами в качестве сигнальных молекул, участвующих в ре-
гуляции различных клеточных процессов [10]. При этом молекула кис-
лорода, выступая в роли акцептора, претерпевает 4 этапа восстановле-
ния с образованием АФК [12]:

O2+1e = O2

•−
супероксид-анион

O2

•− +1e + 2Н+= Н2 О2
пероксид водорода

Н2 О2 +1e + Н+= Н2 О + ОН•
гидроксильный радикал

ОН• +1e + Н+= Н2 О
Однако в биологических системах наряду с АФК образуются дру-

гие активированные кислородные структуры, являясь нормальными 
продуктами обмена веществ или возникая при изменении условий жиз-
недеятельности, в том числе при действии на клетку ионизирующих и 
ультрафиолетовых излучений, ультразвуковых колебаний, различных 
экотоксикантов, а также при многих заболеваниях: 𝑂2

ʹ , 𝐻2𝑂2, 𝑂𝐶𝑙−, 𝑅𝑂2

•

и др. Среди последних можно выделить как свободные радикалы, так и 

кислородсодержащие молекулы, синглентный кислород, гипогалоиды, 
которые не являются радикалами, но взаимодействуют с органиче-
скими молекулами через радикальные механизмы.

Кроме того, неспаренный электрон может быть локализован на 

атомах углерода, серы, азота: для живых организмов важное значение 
имеют тиильные радикалы глутатиона (𝐺𝑆•) или радикалы мочевой 
кислоты с локализацией электрона на атомах S и N [13].

Для объединения в единую систему вышеуказанных реакцион-

ных форм была предложена классификация активных кислородных ме-
таболитов (АКМ) [14] (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Свободные радикалы и активные кислородные соединения

АКМ – это высокореакционноспособные кислородсодержащие 

соединения, образующиеся в живых организмах в результате непол-
ного восстановления молекулярного кислорода [13].

Другая классификация реакционных кислородных форм приве-

дена в работах Ю. А. Владимирова [15–17], где выделяются три катего-
рии активных форм кислорода: первичные, вторичные и третичные. 

Первичные радикалы образуются из молекул за счет реакций од-

ноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. 
Это компоненты дыхательной цепи, такие как радикалы убихинона 
(коэнзима Q), супероксид и окись азота (NO). Вторичными радикалами 
называются те, которые образуются из перекиси водорода, липопере-
кисей и гипохлорита в присутствии ионов двухвалентного железа, потому 
что сами эти радикал-продуцирующие молекулы образуются, как 
правило, из первичных радикалов. К вторичным радикалам относятся 
прежде всего гидроксильный радикал и (с некоторыми оговорками) липидные 
радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных 
жирнокислотных цепей липидов биологических мембран и 

липопротеинов плазмы крови. Наконец, в качестве третичных можно 
рассматривать радикалы, которые образуются при действии вторичных 
радикалов на молекулы антиоксидантов и других легкоокисляющихся 
соединений [16].

Следует подчеркнуть принципиальную разницу в биологическом 

действии первичных и вторичных радикалов. Первичные радикалы 
специально вырабатываются нашим организмом и выполняют жиз-
ненно важные функции переноса электрона в дыхательной цепи (уби-
хинон), защиты от микроорганизмов (супероксид) и регуляции кровя-
ного давления (окись азота), тогда как вторичные радикалы оказывают 
цитотоксическое действие и, как правило, наносят организму большой 
вред. Роль третичных радикалов может быть разной [17].

Избыток АКМ (в литературе чаще используют термин АФК) пред-

ставляет большую опасность вследствие способности повреждать моле-
кулы жизненно важных биополимеров и других компонентов клетки 
[10], вызывая окислительный или оксидативный стресс.  Окислительный 
стресс – важный патогенетический фактор многих заболеваний, осо-
бенно бронхолегочных и сердечно-сосудистых [18, 19], связанных с 
функциональными нарушениями биологических барьеров [13].

Защита клеток, тканей и других биоструктур от токсического 

действия АФК и органических свободных радикалов осуществляется 
[10] антиоксидантами, или антиокислителями. 

В настоящее время отсутствует единое определение понятия «ан-

тиоксидант», что подтверждает нижеприведенная информация.

Согласно определению [20], под такими веществами понимаются 

соединения различной химической природы, способные тормозить или 
устранять свободнорадикальное окисление органических веществ мо-
лекулярным кислородом, что согласуется с определением, приведен-
ным в обзорной литературе [21]. 

Более подробное определение термина «антиоксидант» приве-

дено в [22]. По нему «антиоксиданты – это молекулы, способные бло-
кировать реакции свободнорадикального окисления, восстанавливая 
разрушенные соединения. Когда антиоксидант отдает свой электрон 
окислителю и прерывает его разрушительное действие, он сам окисля-
ется и становится неактивным. Для того чтобы вернуть его в рабочее 
состояние, его надо снова восстановить». 

Или антиоксидант – это молекула, которая ингибирует оксидиро-

вание других молекул [23].

Применительно к молоку и молочной продукции авторы работ 

[24, 25] под антиоксидантами, или ингибиторами окисления, понимают 
«химические соединения, которые замедляют или предотвращают 
окисление липидов молока и молочных продуктов кислородом воздуха, 
в результате которого образуются нежелательные, а порой и токсичные 
вещества, например, различные пероксиды, альдегиды, кетоны, оксо-
кислоты, низкомолекулярные жирные кислоты, снижающие пищевую 
и биологическую ценность продукта».

Для природных антиоксидантных систем характерны различные 

механизмы действия [10]:

1. Ингибирование радикальных форм АКМ, способных отрывать 

атом водорода с образованием органических радикалов.

2. Изменение структурной организации, затрудняющее окисле-

ние.

3. Локальное снижение концентрации О2 и предотвращение его 

включения в окисление.

4. Взаимодействие с органическими радикалами и предотвраще-

ние развития цепных окислительных процессов.

5. Связывание или окисление ионов металлов переменной ва-

лентности, инициирующих разложение перекисей и образование ради-
калов;

6. Перевод перекисей в стабильные продукты окисления: спирты, 

альдегиды, кетоны.

Надо отметить, что основную массу антиоксидантов составляют 

вещества, содержащие подвижный атом водорода. Среди таких антиок-
сидантов можно выделить две большие группы соединений, содержащих 
функциональные ОН-группы (гидроксильные) или SH-группы (тиоль-
ные) [10].

Эффективными перехватчиками радикалов являются фенольные 

антиоксиданты, к которым относятся соединения, имеющие в своей 
структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими 
гидроксильными группами Ar(OH)n. В зависимости от природы арома-
тического фрагмента (Ar) различаются собственно фенолы, а также 
нафтолы и оксипроизводные других гетероароматических соединений. 
В зависимости от числа ОН-групп, присоединенных к одному аромати-
ческому ядру, различают моно- и полифенолы, а от числа фрагментов 
Ar(OH)n – моно- и полиядерные [10].

Главным действующим началом, обеспечивающим фенольным 

антиоксидантам 
способность 
тормозить 
радикальные 
процессы 

окисления, является гидроксильная группа, присоединенная к аромати-
ческому ядру. Благодаря наличию в структуре ароматического кольца 
обобщенной системы -электронов происходит смещение отрицатель-
ного заряда на кислород, результатом чего становится достаточно легкий 
отрыв атома водорода от гидроксила с образованием разных изомерных 
форм фенокси-радикала. Такие соединения выступают перехватчиками 
перекисных и алкоксильных радикалов в реакциях:

RO + ArOH → ROH + ArO,

RO2 + ArOH → ROOH + ArO.

Взаимодействие фенольных антиоксидантов с органическими ра-

дикалами приводит к образованию феноксильных радикалов (ArO), ко-
торые в дальнейшем могут участвовать в реакциях диспропорциониро-
вания с образованием хинолидных перекисей:

ArO + RO2 → RO2ArO,

ArO + ArO → Ar2O2.

В результате распада хинолидных перекисей возникают хинонные 

формы молекул, которые в нормальных условиях не обладают антиокси-
дантными свойствами, однако при дефиците О2 могут тормозить окисле-
ние посредством взаимодействия с алкильными радикалами, например, 
в такой реакции [13]:

Как правило, синтез ароматического кольца возможен только у 

высших растений и микроорганизмов, в то время как животные преиму-
щественно только преобразовывают различные ароматические соедине-
ния, за исключением синтеза убихинона и эстрогенов. Поэтому многие 
из фенольных антиоксидантов входят в группу так называемых «пище-
вых антиоксидантов», т. е. соединений, потребность организма в кото-
рых удовлетворяется поступлением с пищей.

Наряду с фенольными антиоксидантами важную роль в защите ор-

ганизма играют легкоокисляющиеся пептиды, в состав которых входят 
SH-содержащие аминокислоты: цистеин, цистин и метионин (рис. 1.2).

1                               2                     
3 

Рис. 1.2. Структурные формулы цистина (1); цистеина (2); 

метионина (3)

Как показано в экспериментальных исследованиях, при наличии 

в среде SH-содержащих соединений они подвергаются окислению 
в первую очередь, что предохраняет от окисления другие функциональные 
группы и молекулы. По некоторым оценкам, на белки, прежде 
всего SH-содержащие, приходится более 50 % ингибирования синглет-
ного кислорода в плазме [26], процессов ПОЛ в сыворотке [27] и связывания 
НОСl [28]. SH-содержащие соединения также могут вовлекаться 
в ферментативное восстановление фенольных антиоксидантов, 
в частности витамина Е. Механизм действия следующий. При различных 
стрессовых воздействиях и патологических состояниях наблюдается 
обратимая окислительная модификация SH-групп, приводящая 
к увеличению количества дисульфидных связей, что является неспецифической 
реакцией организма на экстремальное воздействие [29, 30]. 
Такая модификация изменяет состояние клеточных мембран, их проницаемость 
и адгезивные свойства, влияет на активность ферментов и 
клеточную пролиферацию [30, 31], вызывает нарушения структуры ци-
тоскелета, способствует высвобождению цинка из металлотионеинов. 
Поэтому соотношение восстановленных и окисленных SH-групп и их 
способность к окислительной модификации (буферная емкость) явля-
ются важными критериями неспецифической резистентности орга-
низма [13].

Важным компонентом антиоксидантной защиты организма [32] 

являются хелатные соединения, связывающие ионы металлов перемен-
ной валентности и тем самым препятствующие их вовлечению в реак-
ции разложения перекисей, так как в присутствии металлов переменной 
валентности усиливается образование высокореакционных гидрок-
сильного и алкоксильного радикалов: