Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии, пролиферации и направленной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток при культивировании на скаффолдах, предназначенных для устранения костных дефектов

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ 
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ 
ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 
 
 
 
 
 
 
 

Научно-методическое руководство  
по изучению механизмов адгезии,  

пролиферации и направленной  

дифференцировки мезенхимальных  

стволовых клеток при культивировании  

на скаффолдах, предназначенных  
для устранения костных дефектов 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
Томск 
Издательский Дом Томского государственного университета 
2019 

Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии 

2 

УДК 616-092:577.21 
ББК 53.53:28.070 
        Н34 

 
Авторы: 
С.А. Александрова, М.И. Блинова, М.А. Булдаков, Е.В. Зубарева,  
Н.А. Михайлова, С.В. Надеждин, Ю.А. Нащекина, Л.А. Покровская,  
М.Г. Хотин, А.А. Чурин, Е.Ю. Шерстобоев 
 
 
Научно-методическое руководство по изучению механизмов 

Н34 
адгезии, пролиферации и направленной дифференцировки 

 
мезенхимальных стволовых клеток при культивировании  

 
на скаффолдах, предназначенных для устранения костных 

 
дефектов / С.А. Александрова, М.И. Блинова, М.А. Булдаков,  
Е.В. 
Зубарева, 
Н.А. 
Михайлова, 
С.В. 
Надеждин,  
Ю.А. Нащекина, Л.А. Покровская, М.Г. Хотин, А.А. Чурин,  
Е.Ю. Шерстобоев. – Томск : Издательский Дом ТГУ, 2019. – 
268 с. 
 
ISBN 978-5-94621-873-3 
 
В методическом руководстве освещаются методики и методы исследова
ния элементов тканеинженерных конструкций in vitro и in vivo, исследования 
МСК в условиях культивирования на композитных матрицах (скаффолдах). 

В материал разделов вошли результаты собственных экспериментальных 

исследований, а также обзоры публикаций в области разработки тканеинженерных конструкций. Есть разделы, посвященные исследованиям безопасности с кратким обзором нормативной базы в данной области. 

Для исследователей в области регенеративной медицины, разработчиков 

материалов и технологий, а также магистрантов и аспирантов биологических и 
химических специальностей. 
 
УДК 616-092:577.21 
ББК 53.53:28.070 
 
Исследования выполнены при поддержке Министерства науки  
и высшего образования РФ, соглашение № 14.575.21.0164,  
идентификатор RFMEFI57517X0164. 
 
 
 
ISBN 978-5-94621-873-3 
 
© Авторы, 2019 
© Томский государственный университет, 2019 

Список сокращений 

3 

 
 
ОГЛАВЛЕНИЕ 
 

Список сокращений ..............................................................................................
 
Введение ..................................................................................................................
 
1. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК)  
в регенеративной медицине ................................................................................
1.1. Морфофункциональные свойства МСК ..................................................
1.2. Источники МСК для целей регенеративной медицины  
и экспериментальных исследований ...............................................................
1.3. Выделение и особенности культивирования МСК костного мозга  
in vitro .................................................................................................................
1.4. Выделение и культивирование МСК жировой ткани ............................
1.5. Выбор маркеров клеточной поверхности для селекции МСК ..............
1.6. Потенциал остеогенной дифференцировки МСК ...................................

Список использованной литературы ........................................................

 
2. Секретом мезенхимальных стволовых клеток  как источник  
факторов роста ......................................................................................................

2.1. Факторы роста, обеспечивающие пролиферацию  
и дифференцировку МСК в остеогенном направлении ................................
2.2. Сигнальные пути в процессе дифференцировки мезенхимальных 
стволовых клеток в остеобласты .....................................................................

Список использованной литературы ........................................................

 
3. Методы исследования МСК и кондиционированной среды (СМ) 
(результаты собственных экспериментальных исследований) ..................
3.1. Исследование in vitro влияния кондиционированной среды (CM)  
на морфологию и адгезию, пролиферацию МСК ..........................................
3.2. Методы исследования in vitro остеоиндуктивных свойств  
экспериментального образца кондиционированной среды (CM) ................

Список использованной литературы ........................................................

 
4. Костнопластические материалы для скаффолдов  
в регенерации костной ткани .............................................................................
4.1. Выбор оптимальных материалов для скаффолдов – носителей МСК ....
4.2. Структура и свойства скаффолдов, используемых  
для культивирования и трансплантации МСК в область  
костных дефектов ..............................................................................................

Список использованной литературы ........................................................

 

5

7

12
12

15

18
24
31
36
41

51

51

69
87

106

108

116
141

144
144

152
154

Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии 

4 

5. Методы оценки адгезии, пролиферации, направленной 
дифференцировки МСК при культивировании на скаффолдах 
(результаты собственных экспериментальных исследований) ...................

5.1. Исследование адгезии и морфологии МСК при культивировании  
на экспериментальных скаффолдах ................................................................
5.1.1. Исследование морфологии клеток сканирующей  
электронной микроскопией .........................................................................
5.1.2. Оценка адгезии и пролиферации клеток  
с применением красителей ..........................................................................
5.1.3. Оценка адгезии и «заселения» скаффолда клеточным  
материалом с красителем AM Calcium Green-1 и конфокальной 
сканирующей микроскопией. 3D-моделирование .....................................
5.2. Исследование дифференцировки МСК при культивировании  
на скаффолдах ...................................................................................................
5.2.1. Исследование накопления ионов кальция в цитоплазме МСК  
при культивировании на скаффолдах .........................................................
5.2.2. Исследование дифференцировки МСК крыс по накоплению 
факторов транскрипции Osterix, Runx2 и AM Calcium Green-1  
и маркерам β-катенину и винкулину ...........................................................
5.2.3. Исследование дифференцировки МСК по накоплению  
факторов транскрипции Osterix, Runx2, YAP1 на клеточной линии 
FetMSC ...........................................................................................................
5.2.4. Исследование формирования кальцификатов ..................................

Список использованной литературы ........................................................
 
6. Исследование остеоиндукции скаффолдов in vivo  
(результаты собственных экспериментальных исследований) ...................
Список использованной литературы ........................................................
 
7. Исследование цитотоксичности .....................................................................

7.1 Исследование цитотоксичности элементов тканеинженерных 
конструкций in vitro ..........................................................................................
7.2 Исследование цитотоксичности скаффолда и СМ  
(результаты собственных экспериментальных исследований) ....................
Список использованной литературы ........................................................
 
8. Исследование безопасности биомедицинских клеточных продуктов ....
8.1. Состояние нормативно-правовой базы по доклиническим  
исследованиям БМКП .....................................................................................
8.2. Проведение исследований безопасности в доклинических  
исследованиях БМКП .......................................................................................

Список использованной литературы ........................................................
 
Заключение .............................................................................................................

159

159

159

161

166

183

184

190

203
210
215

217
238

239

239

245
254

257

257

260
263

265

Список сокращений 

5 

 
 
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 
 
NC – отрицательный контроль 
OC – остеокальцин 
ОР – osteogenic protein 
PC – положительный контроль 
PLGA – полилактидгликолид 
PLGA/ФК(ГАП) – образцы из PLGA, содержащие фосфаты кальция (гидроксиапатит) 
RUNX2 – runt-связанный фактор транскрипции 2 
YAP1 – YES-associated protein 
АК – ализариновый красный 
БКС – базовая культуральная среда 
БМКП – биомедицинский клеточныйй продукт 
ГАП – гидроксиапатит 
ДКИ – доклинические исследования 
ДМСО – диметилсульфоксид 
ДС – дифференцировочная среда 
ИНЦ РАН – Институт цитологии российской академии наук 
КИ – клинические исследования 
КМСН – композитная матрица скаффолда-носителя 
КОЕ-Ф – колониеобразующие единицы фибробластов 
КФ – кальцийфосфатные 
МБК – морфогенетические белки кости 
МСК – мезенхимальные стволовые клетки 
МТТ – метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромид 
ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна – Новосибирский научно-исследовательский 
институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна 
НИ ТГУ – Национальный исследовательский Томский государственный 
университет 
НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН – Научноисследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины 
им. Е.Д. Гольдберга Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук 

Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии 

6 

НИУ «БелГУ» – Белгородский государственный национальный исследовательский университет 
ОИ – остеоиндуктивная активность 
ОК – остеокондукия 
ОКФ – относительное количество кальцификатов 
ОТ – окрашенные точки 
ОФ – относительная флуоресценция 
ПЦР – полимеразная цепная реакция 
РМ – регенеративная медицина 
ССК – стромальные стволовые клетки 
ФК(ГАП) – смесь β-трикальций фосфата и гидроксиапатита  
ФСБ – фосфатно-солевой буфер 
ЩФ – щелочная фосфатаза 
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота 
ЭСК – эмбриональные стволовые клетки 
ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка 

Введение 

7 

 
 
ВВЕДЕНИЕ 
 
Рост числа неинфекционных заболеваний, старение населения, 
ухудшение экологической ситуации и репродуктивного здоровья 
определили запросы здравоохранения на новые методы диагностики, 
лечения и реабилитации, основанные на клеточных и геномных технологиях. 
Регенеративная медицина (РМ) – новейшая отрасль медицинской 
науки. Исследования в области РМ направлены на поиск путей восстановления тканей и/или органов больных с хроническими заболеваниями и состояниями, когда собственные регенераторные возможности организма не способны обеспечить заживление дефекта [1]. Успехи молекулярной и клеточной биологии, эмбриологии и биотехнологии последних лет открыли возможность разработки принципиально 
новых терапевтических продуктов. Фармацевтические компании становятся инвесторами разработок и выходят на рынок производства. 
Поэтому разработки в области регенеративной медицины выходят из 
академического формата и становятся основой для клинических технологий 
и 
биотехнологических 
фармацевтических 
продуктов. 
В 2017 г. более 70 продуктов для РМ одобрены к применению в клинической практике, более 60 проходили III фазу клинических исследований (КИ). Журнал «The Economist» в 2013 г. написал, что «после 
многих лет обещаний РМ приближается к тому, чтобы приносить (результаты)» [2].  
Область РМ входит в число стратегических программ развития 
науки и здравоохранения Европы, Китая, Японии, Америки.  
Так в Китае программа охватывает период до 2050 г. Дорожная 
карта развития науки и технологий Китая имеет девять основных 
направлений и 18 научно-технологических карт, среди которых прогноз развития общественного здоровья и здравоохранения Китая до 
2050 г., включающий в себя следующие разделы: тенденции и национальные особенности общественного здравоохранения Китая, биомедицинские инновационные системы, репродуктивное здоровье и кон

Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии 

8 

троль здоровья населения, питание и пищевая безопасность, хронические неинфекционные заболевания и управление здравоохранением, 
профилактика и контроль за инфекционными заболеваниями, когнитивные науки и психическое здоровье, инновационные препараты и 
биоинжиниринг, регенеративная медицина (РМ) [3] 
Программа ЕС «Horizon 2020», научно-технологического развитию ЕС предполагает создание отдельных подпрограмм по направлениям науки, в частности в вопросах РМ [4]. 
В Прогнозе научно-технологического развития Российской Федерации на период до 2030 года проведена оценка наиболее значимых и 
перспективных отраслей экономики и возможности их развития в современных условиях в Российской Федерации. Анализ проводился по 
семи приоритетным направлениям, одним из которых было «Медицина 
и здравоохранение». Были определены наиболее перспективные рынки 
для данного приоритетного направления: РМ, биодеградируемые материалы, небиодеградируемые материалы, системы диагностики, сложные имплантаты, хирургическая техника, лекарственные средства и 
системы их адресной доставки, системы прижизненной неинвазивной 
визуализации [5, 6]. Разработаны программы государственной поддержки исследований в данной области, в том числе в области регенеративных технологий для замещения костных дефектов. 
Интерес к данной области обусловлен социальной значимостью 
проблемы дефекта костной ткани, которая в абсолютной частоте обусловлена одной из двух причин: остеопорозом или результатом травмы.  
Так, в 1997 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), 
признала, что остеопороз является важной глобальной проблемой 
общественного здоровья и здравоохранения, объявила 20 октября 
Всемирным днем борьбы с остеопорозом [7]. По данным ВОЗ, по распространенности в мире среди неинфекционных заболеваний остеопороз занимает четвертое место после болезней сердечнососудистой системы, онкологической патологии и сахарного диабета 
и имеет тенденцию роста, в связи с увеличением продолжительности 
жизни. Дисбаланс между костной и жировой составляющей костной 
ткани, в конечном итоге ведет к более частым переломам и нарушает 
процессы естественной репарации при переломах и протезировании. 

Введение 

9 

По данным статистики в течение 1-го года после перелома в России умирает до 50% больных, а из выживших – 33% остаются прикованными к постели и нуждаются в постороннем уходе [8]. 
Травматизм является вторым весомым фактором, имеющим последствия. По данным Всемирной организации здравоохранения [7], 
ежегодно в мире происходит около 50 млн не смертельных травм, 
приводящих к проблемам опорно-двигательного аппарата и служащих причинами инвалидности.  
В России около 16% костных травм лечится оперативным путем, 
то есть путем имплантации в организм металлоконструкций [8] или 
костно-пластических материалов [9]. Однако в 42% случаев возникает 
такое осложнение как ложный сустав, что по сути является новым 
дефектом.  
Регенеративная медицина предлагает метод альтернативной имплантации металла (или костно-пластического протеза) в организм. 
Главным преимуществом предлагаемого подхода является теоретическая возможность полного восстановления анатомической целостности кости. Основой метода являются три составляющие: мультипотентные клетки, остеогенные факторы, способные направить клетки 
по костному пути развития, и матрица-носитель (скаффолд) остогенных клеток [10, 11]. Данные конструкции, получили название 
тканеинженерных конструкций. Их разработка и исследование является мультидисциплинарной задачей, поскольку требует комплексного решения в создании и исследовании материалов-элементов конструкций материаловедами, химиками, физиками. Изучение свойств 
остогенных клеток при культивировании на скаффолдах и в присутствии факторов, исследование безопасности все элементов тканеинженерных конструкций, а также постановка материаловедческого поиска и целевых параметров скаффолда, таких как пористость, шероховатость поверхности и многие другие, все это работа медикобиологов.  
В настоящем методическом руководстве предложены апробированные варианты тестирования скаффолдов и кондиционированной 
среды (СМ), как источника факторов роста с заданным вектором 
дифференцировки и кандидата в БМКП Мезенхимальные стволовые 

Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии 

10 

клетки являются и тест системой, в исследование свойств скаффолда 
и СМ, и предполагаемым остеогенным элементом тканеинженерной 
конструкции. 
Поскольку на самых ранних этапах разработки необходимо оценить безопасность и эффективность элементов тканеинженерных конструкций мы осветили методики, применимые к этим задачам с примерами наших исследований. Надеемся, что они могут помочь другим 
исследователям с аналогичными задачами. 
Акцент сделан на исследовании остеоиндуктивных свойств скаффолдов, МСК и кондиционированной среды, содержащей факторы 
роста, как элементов возможной тканеинженерной конструкций, а 
аналитические обзоры помогут искать собственный путь, имея представление о состояние разработок в данной области. 
Подбор кандидатов для тканеинженерных конструкций и их тестирование необходимо оптимизировать и максимально унифицировать для возможности сопоставления потенциальных кандидатов и 
выбора наиболее успешных. 
 
Список использованной литературы 
 

1. Mason C., Dunnill P. A brief definition of regenerative medicine // Regen Med. 
2008. № 3 (1). Р. 1–5. 

2. The Economist. Prometheus unbound: Researchers have yet to realize the old dream 
of 
regenerating 
organs. 
But 
they 
are 
getting 
closer. 
URL: 
http://www.economist.com/news/science-and-technology/21580440-researchershave-yet-realise-old-dream- regenerating-organs-they-are 

3. Yongsiang L. (ed.) Science & Technology in China: A Roadmap to 2050 – Strategic 
General Report of the Chinese Academy of Sciences. Science Press Beijing, 
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2010. 

4. European commission. Horizon 2020. URL: http://ec.europa.eu/programmes/ horizon2020/en 

5. Прогноз научно-технологического развития Российской Федерации на период 
до 2030 года (утв. Правительством РФ 3 января 2014 г.). М. : Министерство 
образования и науки Российской Федерации, 2013. 

6. Корсаков И.Н., Наделяева И.И., Еремин И.И., Пулин А.А., Котенко К.В., Зорин В.Л. Анализ рынка продуктов регенеративной медицины // Гены и клетки. 
2017. № 1. С. 72–89. 
7. Официальный 
сайт 
Всемирной 
организации 
здравоохранения. 
URL: 
http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2009/road_safety_report_20090615/ru 

Введение 

11 

8. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные принципы и технологии остеосинтеза костей 
конечностей, таза и позвоночника». СПб., 2015. 
9. Кирилова И.А., Подорожная В.Т., Легостаева Е.В., Шаркеев Ю.П., Уваркин П.В., Аронов А.М. Костно-пластические биоматериалы и их физико-меха- 
нические свойства // Хирургия позвоночника. 2010. № 1. С. 81–87. DOI: 
10.14531/ss2010.1.81-8 
10. Giannoudis P.V., Einhorn T.A., Schmidmaier G., Marsh D. The diamond concept – 
open questions // Injury, Int. J. Care Injured. 2008. Vol. 39. P. 55–58. 
11. Корель А.В., Кузнецов С.Б. Тканеинженерные стратегии для восстановления 
дефектов костной ткани. Современное состояние вопроса // Международный 
журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2019. № 4. С. 228–
234. 
 

Научно-методическое руководство по изучению механизмов адгезии 

12 

 
 
 
1. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (МСК) 
В РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ 
 
1.1. Морфофункциональные свойства МСК 
 
В середине 1970-х гг. А.Я. Фриденштейном было показано, что 
строма тканей гематогенных органов (костный мозг, тимус, селезенка) взрослых мышей и человека содержит самообновляющиеся негемопоэтические мультипотентные клетки, формирующие колонии 
фибробластоподобных клеток [1]. Дальнейшие исследования разных 
авторов привели к тому, что были выявлены популяции клеток со 
сходными свойствами практически во всех тканях взрослого организма [2]. Первоначально их называли «колоние-образующие единицы 
фибробластов». В 2004 г. Международным обществом клеточной терапии было предложено название «мультипотентные мезенхимальные 
(мезенхимные) стромальные клетки» (МСК) [3] и позже, в 2006 г., 
были определены основные критерии принадлежности клеток к МСК 
популяции. МСК имеют фибробластоподобную морфологию и адгезируют к пластику при стандартных условиях культивирования. МСК 
экспрессируют CD73, CD90, CD105 поверхностные маркеры и не экспрессируют эндотелиальные и гематопоэтические маркеры CD45, 
CD34, CD11b или CD14, CD19, или CD79alpha и HLA-DR. И наконец, 
МСК должны обладать способностью дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондробласты в условиях in vitro [4–6]. Условия 
культивирования могут значительно изменить набор (паттерн) молекул, экспрессируемых на поверхности МСК [6, 7]. При этом экспрессия CD73 и CD105 существенно не зависит от действия факторов 
окружающей среды. Тогда как, экспрессия CD44, CD271, CD146 и 
CD106 изменяется в процессе культивирования [6, 8, 9]. Экспрессия 
маркера CD146 варьируется со временем, а также зависит от содержания кислорода [6, 11], число молекул маркера CD105 значительно