Реакции с участием возбужденных состояний флуоресцеиновых красителей

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Сибирский федеральный университет

Е. А. Слюсарева

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ  
ВОЗБУЖДЕННЫХ СОСТОЯНИЙ  
ФЛУОРЕСЦЕИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ

Монография

Красноярск 
СФУ 
2020

УДК 547.633.6
ББК 24.235.213
С498

Р е ц е н з е н т ы: 

В. В. Салмин, доктор физико-математических наук, доцент, заведующий кафедрой медицинской и биологической физики Красноярского государственного медицинского университета имени профессора 
В. Ф. Войно-Ясенецкого;
В. А. Светличный, кандидат физико-математических наук, доцент, 
заведующий лабораторией новых материалов и перспективных технологий Национального исследовательского Томского государственного 
университета

Слюсарева, Е. А.
С498 
 
Реакции с участием возбужденных состояний флуоресцеиновых красителей : монография / Е. А. Слюсарева. – Красноярск : Сиб. федер. ун-т, 2020. – 170 c.
ISBN 978-5-7638-4314-9

Рассмотрены процессы с участием возбужденных состояний флуоресцеиновых красителей. Представлен экспериментальный и теоретический материал, позволяющий продемонстрировать многообразие возможных фотопроцессов и выявить связь молекулярной структуры с фотофизическими 
и фотохимическими свойствами молекул. Особое внимание уделено возможности использования реакций красителя в возбужденном состоянии в задачах 
сенсорики, записи оптической информации и других областях.
Предназначена для специалистов, чья научная или практическая деятельность связана с созданием и изучением оптических функциональных материалов, а также студентов и аспирантов физических и химических специальностей 
вузов.

Электронный вариант издания см.: 
УДК 547.633.6

http://catalog.sfu-kras.ru 
ББК 24.235.213

Подготовлена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (FSRZ-2020-0008), при поддержке 
РФФИ (проект № 19-02-00450), Правительства Красноярского края, Красноярского краевого фонда науки (проект № 18-43-242003)

ISBN 978-5-7638-4314-9 
© Сибирский федеральный
университет, 2020

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие ................................................................................................5

Глава 1. Систематика фотопроцессов в красителях ...........................9
1.1. Общие понятия. Энергетическая схема красителя ............................9
1.2. Излучательные фотофизические процессы ..................................... 15
1.3. Колебательная релаксация, внутренняя  
и интеркомбинационная конверсии  ................................................. 18
1.4. Тушение нижних возбужденных уровней ....................................... 21
1.5. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения .... 23
1.6. Межмолекулярные взаимодействия ................................................. 28
1.7. Фотоиндуцированный перенос протона  ......................................... 31
1.8. Фотоиндуцированные реакции, приводящие  
к изменению химической структуры красителя ............................. 36
Литература  ................................................................................................ 37

Глава 2. Флуоресцеиновые красители: обратимые процессы  
с участием возбужденных состояний................................................... 39
2.1. Химическое строение и электронные спектры ............................... 39
2.2. Конформация дианионов флуоресцеиновых красителей  
в основном и возбужденном синглетном состояниях ..................... 43
2.3. Спектральные и фотофизические характеристики  
флуоресцеиновых красителей в метаноле и биополимерах ........... 51
2.4. Фотопроцессы, определяемые спин-орбитальным  
внутримолекулярным взаимодействием .......................................... 55
2.5. Безызлучательный перенос энергии  
электронного возбуждения ................................................................ 58
Литература  ................................................................................................ 67

Глава 3. Протолитические свойства красителей  
и перенос протона в возбужденном состоянии .................................. 70
3.1. Ионные равновесия в основном состоянии ..................................... 70
3.2. Спектры поглощения красителей при разных pH ........................... 78
3.3. Влияние pH на флуоресцентные свойства красителей ................... 81
3.4. Ионные равновесия флуоресцеина в возбужденном состоянии .... 84
3.5. Использование переноса протона в возбужденном состоянии  
в задачах биосенсорики ..................................................................... 89
Литература  ................................................................................................ 92

Оглавление

Глава 4. Лазерное обесцвечивание красителей  
в полимерной матрице ........................................................................... 95
4.1. Экспериментальное исследование кинетики  
фотохимической реакции .................................................................. 96
4.2. Моделирование кинетики фотохимической реакции  .................. 103
4.3. Обсуждение механизма фотообесцвечивания  
красителя в полимере ....................................................................... 108
4.4. Влияние акцептора энергии возбуждения  
на кинетику фотохимической реакции донора .............................. 114
4.5. Кинетика фотохимической реакции  
с участием высоковозбужденных состояний красителя ............... 117
4.6. Использование полимерных растворов  
красителей для голографической записи информации ................. 121
Литература ............................................................................................... 129

Глава 5. Межмолекулярные взаимодействия красителей  
с биологическими структурами ......................................................... 132
5.1. Биферментная биолюминесцентная реакция ................................ 132
5.2. Адсорбция красителей на частицах из полисахаридов ................ 139
5.3. Измерение размера излучателя  
с помощью деполяризации люминесценции ................................. 154
5.4 Фосфоресценция при комнатной температуре ............................... 157
Литература ............................................................................................... 159

Послесловие ........................................................................................... 162

Приложение ............................................................................................ 164

ПРЕДИСЛОВИЕ

Научный и практический интерес к фотофизике и фотохимии 
красителей в течение последнего полувека оставался неизменно высоким, лишь смещался фокус в зависимости от насущных потребностей 
и развития технологии. Революция в оптике и фотонике, вызванная 
изобретением и широким применением мощных источников когерентного излучения (лазеров) в 1960-х гг. привела к возникновению нового направления, связанного с использованием красителей с высоким 
выходом люминесценции в качестве активных сред для перестройки 
частоты лазерного излучения. Вслед за появлением лазерной голографии возникла идея применения полимерных растворов красителей для 
3D-записи информации, не исчерпавшая свой потенциал вплоть до настоящего времени. Интенсивные полосы поглощения в видимой и УФобласти спектра позволили использовать красители в качестве фотоинициаторов химических процессов. Фотохимические свойства красителей 
лежат в основе метода фотодинамической терапии, применяемого для 
лечения онкологических заболеваний. Краситель выступает в роли фотосенсибилизатора, способного специфически накапливаться в опухоли 
и образовывать при облучении химически активные формы (свободные 
радикалы, синглетный кислород), приводящие к гибели клеток.
Но, пожалуй, наиболее практически важное применения красители в последние десятилетия находят в биологии и медицине, в первую 
очередь – в качестве чувствительных компонент сенсоров и различных 
маркеров. Так, использование красителей в качестве флуоресцентных 
маркеров позволило осуществлять непрерывную детекцию продуктов 
полимеразной цепной реакции для секвенирования участков молекул 
ДНК, что существенно расширило возможности метода. По сути, эти 
усовершенствования произвели революцию в биологических исследованиях, что имело решающее значения для таких масштабных проектов, 
как «Геном человека». Другой важной областью применения красителей стала флуоресцентная микроскопия, которая в варианте флуоресцентной наноскопии позволяет получить изображения с более высоким разрешением (~10–25 нм), чем обычная оптическая микроскопия, 
ограниченная дифракционным пределом (~300 нм). Так, с помощью 

Предисловие

флуоресцентной наноскопии стало возможным получение изображений 
клеточных органелл на новом уровне детализации, что резко увеличило 
информативность метода.
Во всех случаях речь идет о процессах с участием фотовозбужденных состояний красителей, обладающих избытком электронно-колебательной энергии, на два порядка превышающим эквивалент тепловой 
энергии (величиной порядка kT ~ 0,026 эВ). В зависимости от природы 
молекулы красителя, обусловливающей характер перераспределения 
избытка энергии, можно наблюдать обратимые (например, излучение 
или перенос энергии), либо необратимые (фотохимические реакции) 
процессы. Широкий спектр возбужденных состояний с различной энергией и мультиплетностью приводит к большому разнообразию фотопроцессов с их участием. Изучение и оптимизация этих процессов требует междисциплинарного подхода, состоящего в сочетании широкого 
набора экспериментальных методов – как чисто физических, в том числе спектральных и хроноскопических, так и химических (в частности, 
химической кинетики) с квантово-химическими расчетами.
Отличие данной монографии от известных работ по физической 
химии органических соединений состоит в оригинальной подаче материала. Если классические работы стартуют от явления, а затем демонстрируют его проявление на разных классах органических соединений, 
то здесь во главу угла ставится ряд гомологичных соединений – флуоресцеиновых красителей, отличающихся полнотой и качеством заполнения галогенами их молекулярной структуры. Заместители воздействуют 
на хромофорную группу за счет индуктивного и других эффектов, существенно меняя картину излучательных и безызлучательных процессов. 
Изучение закономерностей в гомологичном ряду красителей позволяет 
не только продемонстрировать многообразие возможных фотопроцессов, но и понять связь молекулярной структуры с фотофизическими 
и фотохимическим свойствами. При этом красители выступают и как 
объекты для демонстрации многообразия свойств, и как яркие примеры, в которых реализуются оптимальные для конкретных приложений 
характеристики. Это дает возможность оптимизации практического 
применения красителей в новых системах/методах, появление которых 
возможно в ближайшем будущем.

Предисловие

Монография структурирована таким образом, чтобы облегчить 
читателю с начальным уровнем знакомства с предметом путь к пониманию специализированного материала.
В первой главе вводятся основные понятия, формулы и определения. Она имеет самостоятельное значение как достаточно компактно изложенный материал по фотофизике и фотохимии красителей, подготавливающий читателя к восприятию последующих оригинальных глав. 
В библиографию к данной главе включены в основном классические 
работы по спектроскопии и фотохимии красителей. С их помощью можно значительно расширить свой кругозор в данной области.
Вторая глава знакомит читателя со спецификой флуоресцеиновых красителей и их фотофизическими свойствами, включающими 
геометрические характеристики молекул в основном и возбужденном 
состоянии, спектральные и кинетические параметры основных фотопроцессов. Придание физическим свойствам строгих количественных 
характеристик необходимо для выявления корреляционных связей и более полного извлечения информации в специализированных исследованиях. В библиографию этой и последующих глав наряду с другими 
современными работами включены оригинальные работы автора.
Третья глава содержит результаты экспериментальных исследований ионных равновесий флуоресцеиновых красителей в основном 
и возбужденном состояниях. Многоступенчатая диссоциация красителей, затрагивающая структуру хромофорных групп, приводит к ярким 
зависимостям спектральных характеристик красителей от pH окружения. Разница между двумя поведениями ионных равновесий в основном 
и возбужденном состояниях приводит к интересному с фундаментальной и прикладной точек зрения явлению фотоиндуцированного переноса протона в возбужденном состоянии.
В четвертой главе, в отличие от предыдущих, рассматривается необратимый химический процесс – лазерное фотообесцвечивание 
красителей в полимерной матрице. Комбинацией экспериментальных 
и теоретических методов изучается механизм реакции и обсуждается 
возможность практического применения системы «краситель в полимерной матрице» в качестве голографического светочувствительного 
материала.

Предисловие

Фокус пятой главы направлен на использование флуоресцеиновых красителей в качестве инструмента исследования межмолекулярных взаимодействий с биомолекулами в явлениях биолюминесценции 
и связывания (адсорбции). В этой главе показано, как использование 
ряда красителей с плавно меняющимися свойствами решает проблему 
выявления природы этих взаимодействий.
В монографию вошел большой пласт оригинального материала, 
представленного автором в период с 1998 по 2014 г. в виде двух диссертационных работ, а также многочисленных более поздних публикаций 
в российских и международных научных журналах. Опубликованные 
результаты были получены в рамках как инициативных, так и поддержанных российскими и зарубежными научными фондами проектов. 
Автор благодарит своих коллег: проф. А. Г. Сизых, проф. А. Пенцкофера, к.х.н. Ф. Н. Томилина, М. А. Герасимову, к.ф. - м.н. Н. В. Слюсаренко в соавторстве с которыми были не только получены, но и, что 
гораздо более ценно, осмыслены экспериментальные и теоретические 
результаты. Незаменимыми помощниками стали студенты и аспиранты 
Л. Л. Татаринова, А. Тиаги, Е. А. Макарова, А. А. Гайсин, А. А. Глушков, М. В. Атаманова, Д. П. Суржикова, В. И. Третьякова, которых автор искренне благодарит за энтузиазм и трудолюбие. Многие из них 
и сейчас продолжают успешно заниматься научной работой в России 
и за рубежом. Неоценимую помощь в подготовке монографии оказал 
соавтор ряда последних публикаций, коллега по работе в Гельмгольцевском научном центре (Берлин) и Техническом университете Дрездена, 
д-р А. Ю. Плотников, ставший научным и техническим консультантом, 
а также первым читателем этого труда.

ГЛАВА 1

СИСТЕМАТИКА ФОТОПРОЦЕССОВ  
В КРАСИТЕЛЯХ

В первой главе мы очертим круг интересов такой межпредметной 
области науки, как фотоника, и рассмотрим наиболее типичные фотопроцессы в красителях. Спектр реакций с участием возбужденных состояний красителей гораздо более разнообразен, чем процессов с участием их основного состояния. Возбужденные состояния имеют разные 
природу (мультиплетность), уровни возбуждения (запас электронно-колебательной энергии), что обуславливает высокую реакционную способность и сложный баланс между излучательными и безызлучательными переходами между ними. Различная скорость процессов может 
приводить как к одновременному и конкурентному, так и последовательному протеканию событий во временном диапазоне, простирающемся от милли- до фемтосекунд. Тем не менее именно реакции красителя в возбужденном состоянии представляют наибольший интерес для 
таких областей, как сенсорика, оптоинформатика, фотовольтаика и др.

1.1. Общие понятия.  
Энергетическая схема красителя

Красители – это органические соединения разных классов, способные интенсивно поглощать и преобразовывать световую энергию 
в видимом, а также близлежащих ультрафиолетовом и инфракрасном 
спектральных диапазонах, что воспринимается человеческим зрением 
как эффект окраски [1]. Молекулы большинства красителей содержат 
планарную (или близкую к планарной) систему сопряженных двойных 
связей, включающих как ароматические (замкнутые, «кольцевые»), так 
и полиеновые («цепочные») фрагменты. Принадлежность красителя 
к тому или иному классу соединений определяется структурой молекулы, а именно топологией системы сопряженных двойных связей и нали

Глава 1

чием гетероатомов. Для обозначения научной области, занимающейся 
исследованием процессов преобразования оптических сигналов (потоков фотонов) веществами, академиком А. Н. Терениным (и независимо 
от него французским физиком П. Огреном) в 1967 г. был введен термин 
«фотоника», который обозначает совокупность взаимосвязанных фотофизических и фотохимических процессов [2]. 
Поглощение веществом электромагнитного излучения в УФ и видимой областях спектра связано с переходом внешних (валентных) электронов молекул на разрыхляющие орбитали. В сопряженных системах 
происходит делокализация π-электронов, что приводит к повышению их 
подвижности и появлению интенсивных полос поглощения в видимой 
области спектра. В отдельных случаях определенные полосы поглощения можно отнести к переходам, которые локализованы в некоторых частях молекулы, но в целом поглощение электромагнитного излучения 
есть свойство системы ее связей в целом [3].
Уже к середине прошлого века были сформулированы основные 
закономерности, связанные с фотовозбужденными состояниями органических красителей [4]. М. Каша, Г. Н. Льюис экспериментально установили:
1) независимо от первоначального уровня возбуждения молекулы 
испускание происходит преимущественно из первого синглетного и/или 
триплетного состояний;
2) величина квантового выхода флуоресценции из первого синглетного состояния не зависит от того, какое высшее синглетное состояние было возбуждено, поскольку из высших возбужденных синглетных 
состояний происходит быстрая внутренняя конверсия;
3) при увеличении разности энергий между уровнями рассматриваемых состояний скорость безызлучательного перехода резко снижается.
При этом характер спектров испускания и поглощения органических красителей имеет ряд закономерностей: спектры поглощения 
представляют собой несимметричный сплошной контур шириной около 
100 нм; спектр испускания всегда сдвинут по отношению к спектру поглощения в сторону длинных волн (стоксов сдвиг); спектральные кривые поглощения и испускания подчиняются правилу зеркальной симметрии (правило В. Л. Левшина) [2]. Если первые две закономерности 
выполняются строго, то последняя носит качественный характер: при 

Систематика фотопроцессов в красителях 

ее выполнении можно судить о том, насколько близки структуры колебательных уровней основного и возбужденного электронных состояний 
и выявить положение чисто электронного 0–0 перехода как спектральное расположение точки пересечения контуров.
Утвердившиеся в настоящее время в литературе представления 
о происхождении сплошных спектров красителей отводят особую роль 
процессам внутримолекулярной колебательной релаксации. Спектр 
сложной молекулы рассматривается как суперпозиция непрерывных 
спектральных линий, соответствующих франк-кондоновским переходам некоторого обобщенного колебания, дискретность энергетических 
уровней которого нарушена вследствие внутримолекулярных взаимодействий [5]. Таким образом, возможность перераспределения колебательной 
энергии внутри молекулы играет важную роль в формировании спектров. 
Соотношение константы скорости перераспределения колебательной 
энергии с величиной, обратной времени жизни возбужденного состояния, 
определяет параметр сложности молекулы. Так, «сложными» принято называть молекулы, у которых это соотношение значительно больше единицы. «Простые» молекулы характеризуются обратным соотношением этих 
величин, а «полусложные» занимают промежуточное положение. При 
этом красители с их большим числом атомов и наличием системы сопряженных двойных связей относятся, как правило, к типу сложных молекул. 
Наглядные представления о фотопроцессах в сложных молекулах 
можно получить, используя диаграмму Яблонского [4, 6, 7]. В ней обычно отображены нижние синглетные и триплетные электронные уровни 
молекулы, а также совокупность переходов между ними, приводящих 
к перераспределению населенностей. Открытие лазеров, включение 
многоступенчатых и многофотонных процессов, а также прогресс в измерительной, главным образом, хроноскопической технике, привели 
к тому, что в настоящее время стала распространена расширенная версия этой энергетической схемы. В ее рамках в рассмотрение включают 
большее число возбужденных уровней и более широкий спектр внутримолекулярных процессов (рис. 1.1).
Для учета различных способов фотовозбуждения примем в рассмотрение систему синглетных (основной S0, первый S1 и высший возбужденный Sn) и триплетных (первый T1 и высший возбужденный Tn) 
уровней. Каждый из них имеет свою колебательную подсистему,  

Глава 1

поэтому в целом уровень характеризуется как электронно-колебательный 
(или вибронный). Подбирая условия возбуждения, можно реализовать 
один или сразу несколько режимов заселения энергетических уровней: 
однофотонное возбуждение в первое синглетное состояние (с константой 
скорости 

1 

 

01
погл
k
 
0
погл

n
k
 
1
погл

n
k
 
1

T
S
k
 
1
T
T
k  
 

 
 
 
0 exp
.
t
I t
I










 
(1.4) 

 

 
1

фл
T
икк

1
.
S
k
k
k
 


 
(1.5) 

 

 

1

3
погл
рад
3
фл
0

( )
( )
( )
8
S
S

I
d
n

I
d
сn
d


 




 










. 
(1.6) 

 

 
1

фл
фл

фл
T
икк

S
k

k
k
k





 
(1.7) 

или 

 
фл

рад

.


 
 
(1.8) 

 

 
||

||
2

I
I
r
I
I








. 
(1.9) 

 

 
0
1
r
r


   , 
(1.10) 

 

 

3

6

V
D

kT
kT



 

. 
(1.11) 

 
 
 


exp
i
i

i
r t
B
t

 

, 
(1.12) 

 

 
2
2

икк
вк
1
2
1
2
ˆ
,
~
|
|
|
,
i
j
i
j
k
k
H

  

 

 
(1.13) 

ˆH  

), однофотонное возбуждение в высшее синглетное состояние (

1 

 

01
погл
k
 
0
погл

n
k
 
1
погл

n
k
 
1

T
S
k
 
1
T
T
k  
 

 
 
 
0 exp
.
t
I t
I










 
(1.4) 

 

 
1

фл
T
икк

1
.
S
k
k
k
 


 
(1.5) 

 

 

1

3
погл
рад
3
фл
0

( )
( )
( )
8
S
S

I
d
n

I
d
сn
d


 




 










. 
(1.6) 

 

 
1

фл
фл

фл
T
икк

S
k

k
k
k





 
(1.7) 

или 

 
фл

рад

.


 
 
(1.8) 

 

 
||

||
2

I
I
r
I
I








. 
(1.9) 

 

 
0
1
r
r


   , 
(1.10) 

 

 

3

6

V
D

kT
kT



 

. 
(1.11) 

 
 
 


exp
i
i

i
r t
B
t

 

, 
(1.12) 

 

 
2
2

икк
вк
1
2
1
2
ˆ
,
~
|
|
|
,
i
j
i
j
k
k
H

  

 

 
(1.13) 

ˆH  

), двухступенчатое возбуждение, вторым этапом которого является переход из первого в высшее триплетное состояние (

1 

 

01
погл
k
 
0
погл

n
k
 
1
погл

n
k
 
1

T
S
k
 
1
T
T
k  
 

 
 
 
0 exp
.
t
I t
I










 
(1.4) 

 

 
1

фл
T
икк

1
.
S
k
k
k
 


 
(1.5) 

 

 

1

3
погл
рад
3
фл
0

( )
( )
( )
8
S
S

I
d
n

I
d
сn
d


 




 










. 
(1.6) 

 

 
1

фл
фл

фл
T
икк

S
k

k
k
k





 
(1.7) 

или 

 
фл

рад

.


 
 
(1.8) 

 

 
||

||
2

I
I
r
I
I








. 
(1.9) 

 

 
0
1
r
r


   , 
(1.10) 

 

 

3

6

V
D

kT
kT



 

. 
(1.11) 

 
 
 


exp
i
i

i
r t
B
t

 

, 
(1.12) 

 

 
2
2

икк
вк
1
2
1
2
ˆ
,
~
|
|
|
,
i
j
i
j
k
k
H

  

 

 
(1.13) 

ˆH  

). Константа скорости таких переходов определяется произведением квантовой 
интенсивности света Iкв и сечения поглощения σ (λ) молекул вещества:

 
kпогл (λ) = Iкв σ (λ). 
(1.1)

Это выражение содержит как характеристику возбуждающего 
света, так и поглощательную способность вещества на длине волны λ. 
Определить σ (λ), зная пропускание T образца, его толщину l (в см), концентрацию N (в см–3) поглощающего вещества (если речь идет о растворе), можно, основываясь на законе Бугера – Ламберта – Бера:

 
T (λ) = e –σ (λ) N l. 
(1.2)

Сечение поглощения имеет размерность площади, которой в первом приближении можно придать определенный физический смысл. 

Рис. 1.1. Расширенная диаграмма Яблонского для сложной молекулы 
(см. пояснения в тексте)