Биоинженерия растений. Основные методы

Изложены теоретические материалы о принципах 
генетической трансформации, культивирования и 
использования рекомбинантных растений. Подробно рассмотрены методы выявления последовательностей нуклеиновых кислот с помощью 
ПЦР с детекцией в реальном времени. Приведены 
рекомендации к лабораторным работам по дисциплине «Биоинженерия».

М. Г. Куцев, М. В. Скапцов, И. Е. Ямских
БИОИНЖЕНЕРИЯ  РАСТЕНИЙ
ОСНОВНЫЕ  МЕТОДЫ

Учебное пособие

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ  
И БИОТЕХНОЛОГИИ

Оглавление 

1 

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации 
Сибирский федеральный университет 
 
 
 
 
 
 
 
 
М. Г. Куцев, М. В. Скапцов, И. Е. Ямских 
 
 

БИОИНЖЕНЕРИЯ  РАСТЕНИЙ 
 

ОСНОВНЫЕ  МЕТОДЫ 
 
 

Учебное пособие 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Красноярск 
СФУ 
2020 

Биоинженерия растений. Основные методы 

2 

УДК 581.19:602.6(07)  
ББК 28.540.4я73 
        К958 
 
 
 
 
Р е ц е н з е н т ы:  
А. И. Шмаков, доктор биологических наук, профессор, директор 
учебно-производственной базы практик «Южно-Сибирский ботанический 
сад» ФГБОУ ВО «Алтайский государственный университет»; 
Н. В. Фризен, доктор биологических наук, профессор, зам. директора Ботанического сада Университета Оснабрюк, Германия 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Куцев, М. Г. 
К958     Биоинженерия растений. Основные методы : учеб. пособие /              
М. Г. Куцев, М. В. Скапцов, И. Е. Ямских. – Красноярск : Сиб. федер. 
ун-т, 2020. – 80 с. 
ISBN 978-5-7638-4321-7 
 
Изложены теоретические материалы о принципах генетической трансформации, культивирования и использования рекомбинантных растений. Подробно рассмотрены методы выявления последовательностей нуклеиновых        
кислот с помощью ПЦР с детекцией в реальном времени. Приведены рекомендации к лабораторным работам по дисциплине «Биоинженерия». 
Предназначено для магистрантов, обучающихся по направлению 06.04.01 
«Биология», профилю подготовки 06.04.01.06 «Геномика и биоинформатика». 
 
 
Электронный вариант издания см.: 
http://catalog.sfu-kras.ru 
УДК 581.19:602.6(07) 
ББК 28.540.4я73 
 
ISBN 978-5-7638-4321-7                                                           © Сибирский федеральный  
                                                                                                         университет, 2020 

Оглавление 

3 

 
ОГЛАВЛЕНИЕ 
 
ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... 4 
 
Г л а в а  1.  ИСТОРИЯ   ГЕННОЙ  ИНЖЕНЕРИИ  РАСТЕНИЙ ................. 5 
 
Г л а в а  2.  ОСНОВНЫЕ  МЕТОДЫ   
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ  ТРАНСФОРМАЦИИ  РАСТЕНИЙ .......... 12 
 
Г л а в а  3.  БИОЛОГИЧЕСКИЕ  И  МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ   
ОСОБЕННОСТИ  AGROBACTERIUM  TUMEFACIENS .......... 17 
 
Г л а в а  4.  ОСНОВЫ  ВВЕДЕНИЯ  ТРАНСГЕННЫХ  РАСТЕНИЙ   
В  КУЛЬТУРУ  IN  VITRO ........................................................... 26 
 
Г л а в а  5.  ВЫЯВЛЕНИЕ  ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ   
НУКЛЕИНОВЫХ  КИСЛОТ  С  ПОМОЩЬЮ  ПЦР   
С  ДЕТЕКЦИЕЙ  В  РЕАЛЬНОМ  ВРЕМЕНИ .......................... 32 
5.1. Низкоспецифичная детекция результатов ПЦР-РВ  
с помощью интеркалирующих красителей ........................ 34 
5.2. ПЦР в реальном времени c использованием  
специфичных зондов ............................................................ 35 
5.3. Специфичные меченые праймеры ....................................... 46 
5.4. Сравнение некоторых методов  
флуоресцентной детекции ................................................... 55 
 
Г л а в а  6.  ЛАБОРАТОРНЫЕ  РАБОТЫ ..................................................... 58 
Лабораторная работа 1. Выделение ДНК из генетически  
модифицированных растительных образцов ....... 58 
Лабораторная работа 2. Амплификация гена CP4 EPSPS ............................. 59 
Лабораторная работа 3. Количественная ПЦР гена CP4 EPSPS .................. 61 
Лабораторная работа 4. Клонирование ДНК с помощью 
набора Quick-TA (Евроген, Россия) ...................... 62 
 
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ  СПИСОК ............................................................ 68

Биоинженерия растений. Основные методы 

4 

 
ВВЕДЕНИЕ 

 
 
В учебном пособии рассматриваются современные аспекты биоинженерии растений. Изданные в последние годы учебники по дисциплине 
«Биоинженерия» освещают в основном вопросы генетической трансформации бактерий. Данные о методах изучения  трансгенных растений весьма 
ограничены и отрывочны. Подавляющее число литературных источников 
по данному направлению опубликовано на английском языке. В связи 
с этим возникла необходимость написания данного учебного пособия, целью 
которого является формирование у магистрантов, обучающихся по профилю 
«Геномика и биоинформатика», знаний о принципах генетической трансформации, культивирования, выявления и практического использования 
рекомбинантных растений. 
Актуальность данного пособия обусловлена также изменениями 
в образовательных стандартах магистрантов, значительном сокращении 
аудиторной нагрузки, увеличении объёма самостоятельной работы, а также 
развитии дистанционных форм обучения, что вызывает необходимость  
сосредоточить внимание магистранта на основном круге проблем биоинженерии растений, а также на задачах, которые находят практическое приложение в биологии, медицине и сельском хозяйстве. 

Данное учебное пособие включает главы по основам введения трансгенных растений в культуру in vitro, методам генетической трансформации 
и выявления последовательностей нуклеиновых кислот с помощью ПЦР 
с детекцией в реальном времени. Важной составляющей данного учебного 
пособия является раздел, посвященный проведению лабораторных занятий 
по дисциплине «Биоинженерия». Следует отметить, что большинство описанных в учебном пособии методик использовано авторами в своих научных исследованиях. 
Предназначено для магистрантов, обучающихся по направлению 
06.04.01 «Биология», профилю подготовки 06.04.01.06 «Геномика и биоинформатика».

Г л а в а  1.  История генной инженерии растений 

5 

 
Г л а в а  1 

 
ИСТОРИЯ  
ГЕННОЙ  ИНЖЕНЕРИИ  РАСТЕНИЙ 
 
 
Важнейшей задачей молекулярной биологии и генно-инженерной 
экспериментальной биологии растений является получение видов с новыми заданными свойствами. Одним из перспективных и быстро развивающихся направлений растительного «биофарминга» и генной инженерии 
является использование трансгенных растений в качестве продуцентов 
биологически активных веществ и соединений для медицины, сельского 
хозяйства и различных промышленных технологий. Актуальность создания 
таких растений обусловлена также непрекращающимся ростом населения 
и связанным с ним ростом потребностей человека в продуктах питания, так 
как потребности человека безграничны, а ресурсы, напротив, ограничены. 
Следует учитывать и возрастающие запросы медицины в получении качественных и дешёвых лекарств, которые с успехом могут быть решены благодаря методам генной инженерии. Примером могут служить работы по 
трансфекции гена эритропоэтина (стимулятора кроветворения) в клетки 
сосудистых растений с помощью бактериальной плазмиды Agrobacterium 
tumefaciens. 
Трансформация растений генами, ответственными за синтез клеточных метаболитов, позволяет получать растения со сверхэкспрессией важных биологически активных соединений. С другой стороны, подавление 
экспрессии генов с использованием антисмысловых и интерферирующих 
РНК предоставляет возможность получать растения с изменёнными физиолого-биохимическими характеристиками и создавать виды, устойчивые 
к фитопатогенам. 
Вещества, получаемые из трансгенных растений, имеют ряд преимуществ: 
● во-первых, они дёшевы и относительно легки в получении, что позволит распространять их в страны с разным уровнем экономического благополучия; 
● во-вторых, трансгенные растения могут произрастать на любых типах почв, даже самых неблагоприятных для роста; 
● в-третьих, можно достичь максимального продуцирования растительным организмом необходимого вещества. 

Биоинженерия растений. Основные методы 

6 

В биоинженерии важнейшей задачей является подбор подходящего 

вектора. Вектор – это молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-реципиент. Несмотря на 
то, что было предложено большое разнообразие векторов на основе растительных вирусов, к настоящему времени ни один из них детально не разработан. Эти векторы характеризуются рядом недостатков, в частности  
узкой специфичностью в отношении заражаемого растения, ограничениями 
размера вставки и нестабильностью. Последнее замечание связано с тем, 
что упомянутые вирусы реплицируются автономно и не интегрируются 
в ядерный геном растительных клеток. 
Указанные причины заставили учёных сконцентрировать внимание 
на векторах, сконструированных на основе опухолеродных, так называемых 
Ti-плазмид, обнаруженных в клетках почвенной бактерии Agrobacterium 
tumefaciens (Клонирование ДНК..., 1988). 

Опухолевое заболевание растений, известное как корончатый галл, 

описал ещё Аристотель. В 1907 году Е. Смит и К. Таундсен показали, что 
это заболевание вызывает почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens, 
способная приводить к образованию опухолей у некоторых представителей голосеменных и большинства двудольных покрытосеменных растений. 
В 1940-х годах была выдвинута гипотеза о том, что растительные клетки 
трансформируются из-за того, что бактерия вводит в них некий агент, индуцирующий опухоль. Клетки корончатых галлов во многих отношениях 
напоминают раковые клетки животных. Они приобретают способность 
к неограниченному нерегулируемому росту. Когда клетки корончатых галлов культивируют in vitro, они растут в отсутствие специальных гормонов, 
которые необходимы при культивировании нормальных растительных 
клеток. Более того, клетки корончатых галлов продолжают сохранять эти 
свойства (трансформированный фенотип), даже если убить агробактерии 
антибиотиками. Изучение природы индуктора опухолей A. tumefaciens позволило установить в 1974 году, что собственно опухолеродным агентом 
у этой бактерии является плазмида Ti (от англ. tumor inducing), размер которой обычно составляет 200–250 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.). 
В 1977 году М. Чилтон с коллегами обнаружили, что плазмида Ti содержит так называемую Т-ДНК (от англ. transferred DNA), размер которой 
в разных плазмидах варьирует от 10 до 30 т.п.н. 
Новый импульс развитию генетической инженерии растений дала 
разработка альтернативной стратегии использования Agrobacterium для 
доставки целевых генов в растительные клетки. В 1983 году А. Хоекама 
и А. де Фреммонд с коллегами независимо друг от друга обнаружили, что 
Т-ДНК и гены vir (от англ. virulence) могут находиться у агробактерий на 

Г л а в а  1.  История генной инженерии растений 

7 

двух разных репликонах (в транс-положении), и при этом происходит эффективный перенос в растения Т-ДНК. А. Хоекама с соавторами назвали 
основанный на этом подход бинарной векторной системой. Плазмиду, содержащую Т-ДНК, называют вектором, а плазмиду, несущую гены vir, – помощником (хелпером). Хелперная плазмида представляет собой Ti-плазмиду 
с делецией всей Т-ДНК или её части, т. е. она обеспечивает все функции 
переноса Т-ДНК, но не содержит последней. Такая Ti-плазмида называется 
«обезоруженной» (Gelvin, 2003). 
Следует отметить, что Т-ДНК успешно переносится в клетки растений даже при очень большом размере вставки. Так, в 1992 году А. Миранда с коллегами первыми показали, что при изменении ориентации участка 
RB Т-ДНК в растения может переноситься полная копия Ti-плазмиды. 
В 1996 году К. Гамильтон с коллегами, используя бинарную векторную 
систему, осуществили перенос из Agrobacterium в растительные клетки 
фрагментов хромосомной ДНК человека размером до 150 т.п.н. (Щелкунов, 2004). 
Для медицинских целей растения используют на протяжении нескольких тысяч лет, но генетическая инженерия позволила создать новые 
растения, белковые продукты которых важны для терапии различных заболеваний. Гены терапевтически важных белков человека и животных 
можно вводить в разные системы экспрессии, каждая из которых имеет 
свои достоинства и недостатки. Идеальной является система экспрессии, 
которая наиболее безопасна и обеспечивает продукцию биологически активного продукта по минимальной цене. В системе клеток млекопитающих 
могут синтезироваться белки человека и животных, в максимальной степени схожие с природными, но культивирование таких клеток дорого и ограничено по масштабу. Бактерии можно производить в большом масштабе, 
но синтезируемые в них эукариотические белки далеко не всегда имеют 
правильную третичную структуру. Кроме того, они не могут подвергаться 
посттрансляционной модификации. 
Наработка рекомбинантных белков в растениях имеет ряд потенциальных преимуществ перед другими системами экспрессии чужеродных 
генов. Растительные системы более дёшевы по сравнению с культивированием в биореакторах (ферментёрах). Все, что требуется для нормальной 
жизнедеятельности растений, – это минеральные соединения, содержащиеся 
в почве, вода, энергия солнечного света и углекислый газ. 
В растениях возможна посттрансляционная модификация синтезируемых чужеродных полипептидов. Обязательным условием образования 
функционально активных белков является правильная укладка полипептидной цепи. У млекопитающих за это отвечают, по крайней мере, два шаперона –BiP/GRP78 и GRP94. В высших растениях сигнальные последова

Биоинженерия растений. Основные методы 

8 

тельности (например, Lys-Arg-Glu-Leu на С-конце полипептида) направляют белки в эндоплазматический ретикулум, где обнаружены шапероны, 
гомологичные BiP/GRP78 и GRP94 (McBride, Summerfelt, 1990). 
Важной особенностью растений по сравнению с культурами клеток 
млекопитающих и трансгенными животными является то, что в них не могут развиваться такие патогены человека и животных, как вирусы, прионы 
и др., что обеспечивает гораздо бόльшую безопасность генно-инженерных 
продуктов, выделенных из растений. Примеры растений-продуцентов терапевтически важных белков человека приведены в табл. 1. 
 
Таблица 1 

Примеры продукции трансгенными растениями белков человека  
для возможного терапевтического применения 

Заболевания,  

синдромы 

Растениереципиент 
Белки 
Уровень экс
прессии 

Год 

опубликования

Анемия 
Табак 
Эритропоэтин 
< 0,01 % СРБ1 
1997 

Передозировка 
наркотиков 

Арабидопсис
Энкефалины 
0,10 % белка 

семян 

1997 

Цирроз 
печени, 

ожоги, хирургические травмы 

Табак 
Сывороточный альбумин
0,02 % СРБ 
1997 

Кровопотеря 
Табак 
-, β-глобин 
0,05 % белка 

семян 

1997 

Гиперкоагуляция 
Табак 
Протеин С 
< 0,01% СРБ 
1999 

Рапс 
Гирудин (ингибитор 

тромбина) 

0,30 % белка 

семян 

1999 

Гепатиты А и В 
Рис, репа 
α-интерферон 
Нет данных 
1999 

Табак 
β-интерферон 
< 0,01 % СВ2 

Нарушение синтеза 
коллагена 

Табак 
Гомотримерный колла
ген 

< 0,01 % СВ 
1999 

Нейтропения 
Табак 
Гранулоцит-макрофаг 
колониестимулирую
щий фактор 

Нет данных 
2000 

Недостаток гормона роста 

Табак 
Соматотропин 
< 0,01 % СРБ 
2000 

Пузырный фиброз, 
заболевания печени, кровотечения 

Рис 
α-1-антитрипсин 
Нет данных 
2000 

П р и м е ч а н и е: 1 СРБ – суммарный растворимый белок. 
                                                2 СВ – сырой вес. 
 
Технологии сбора и обработки растений в больших масштабах уже 
существуют, что значительно упрощает и удешевляет работу с посевами 

Г л а в а  1.  История генной инженерии растений 

9 

трансгенных растений. Белки, продуцируемые в семенах, клубнях, плодах, 
обладают значительной стабильностью и могут сохраняться в них без выделения длительное время. 
Значительную долю в стоимость рекомбинантных белков медицинского назначения вносит их очистка. При синтезе некоторых белков в зерне 
риса, пшеницы, плодах томата, бананов и др. возможно их введение в организм алиментарным путем (с пищей) без предварительной очистки, что 
значительно снизит стоимость таких препаратов. 
Метод получения моноклональных антител в гибридах разработали 
Г. Кохлер и К. Милстейн в 1975 году. Вследствие своей высокой специфичности для широкого спектра антигенов антитела и их фрагменты нашли широкое применение как для диагностических целей, так и в терапии 
различных заболеваний. Учитывая потенциальные преимущества генноинженерной системы растений, заманчиво было бы клетки млекопитающих при производстве антител заменить на растительные. 
А. Хиатт с коллегами в 1989 году первыми создали трансгенные растения табака, продуцирующие функционально активные моноклональные 
антитела IgG1. Для этого ДНК-копии матричных РНК, выделенных из 
мышиной гибридомы 6D4 и кодирующих легкую (каппа) и тяжелую (гамма) 
цепи иммуноглобулина IgGl, встроили в агробактериальный бинарный 
экспрессирующий вектор. Полученные для каждой цепи иммуноглобулина 
гибридные конструкции перенесли в клетки табака. На селективной среде 
отобрали трансгенные растения и охарактеризовали продукцию соответствующих целевых белков. Трансформанты, продуцирующие индивидуальные 
цепи иммуноглобулина, скрестили и получили потомство, экспрессирующее одновременно обе цепи. В таких растениях цепи обоих типов объединялись и образовывали функционально активные молекулы, специфично 
связывающиеся с соответствующими антигенами. Функциональные антитела в растениях табака накапливались в количестве, достигающем 1,3 % 
суммарного белка листьев. Экспериментально было установлено, что для 
сборки молекулы иммуноглобулина необходима секреция обеих цепей,         
т. е. каждая цепь должна синтезироваться в виде пребелка, на N-конце которого находится сигнальный пептид. 
В дальнейшем в ряде лабораторий были получены трансгенные растения, которые продуцировали различные полноразмерные иммуноглобулины, либо так называемые одноцепочные вариабельные фрагменты           
(single-chain variable fragment, scFv) иммуноглобулинов, представляющие 
собой вариабельные области тяжёлой и легкой цепей, соединенные линкерным пептидом. 
Различия в гликозилировании белков, синтезированных в клетках 
растений и млекопитающих, – главная проблема при использовании их 

Биоинженерия растений. Основные методы 

10 

в медицине. Гликопротеины, продуцированные в растениях, имеют две дополнительные углеводные детерминанты: β (1,2)-ксилозу и α (1,3)-фукозу. 
Было высказано предположение, что такие олигосахаридные остатки, не 
найденные в N-гликанах млекопитающих, могут оказаться аллергенными 
для человека: в крови экспериментальных животных обнаружены специфические IgE против растительных углеводных детерминант. Хотя это не 
может напрямую расцениваться как показатель аллергии, тем не менее 
лучше избегать возможных побочных эффектов при использовании рекомбинантных белков в клинической практике. Сравнение процессов синтеза 
N-гликанов в клетках растений и млекопитающих показало, что ключевым 
ферментом, способным превращать растительные N-гликаны в N-гликаны 
млекопитающих, является β (1,4)-галактозил-трансфераза. X. Бэккер с коллегами (2001) провели скрещивание трансгенных растений табака, экспрессирующих этот фермент, с растениями, продуцирующими одновременно 
тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина. В потомстве, продуцирующем 
три чужеродных белка, до 30 % молекул иммуноглобулина содержали галактозилированные N-гликаны. 
В 1992 году Х. Мэйсон с группой коллег впервые сформулировали 
концепцию производства вакцин в трансгенных растениях. Они предприняли попытку получения съедобной вакцины против вируса гепатита В на 
основе трансгенного табака. Были созданы растения, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В. Рекомбинантный HBsAg выделили  
из трансгенных растений с помощью иммуноаффинной хроматографии и исследовали под электронным микроскопом. Оказалось, что рекомбинантный HBsAg способен собираться в вирусоподобные частицы размером 
около 22 нм и взаимодействовать с антителами, выделенными из крови 
лиц, инфицированных HBV. Вакцинация мышей инъекционным способом 
HBsAg антигеном, выделенным из трансгенных растений табака, стимулировала такой же специфичный иммунный ответ, как и коммерческая 
дрожжевая субъединичная вакцина. Это исследование показало возможность создания трансгенных растений для получения рекомбинантных вирусных белков, обладающих нормальной биологической активностью. 
На следующем этапе был создан трансгенный картофель, продуцирующий HBsAg, и при скармливании мышам клубней такого картофеля 
наблюдали развитие специфичного иммунного ответа против вируса гепатита В. В 1999 году были начаты эксперименты на добровольцах, и у людей, 
поедавших сырые клубни этого картофеля, также наблюдали специфичный 
противовирусный иммунный ответ. 
Другая группа исследователей в 1999 году создала съедобную вакцину 
против вируса гепатита В на основе люпина и салата. У мышей, которым 
скармливали люпин, наблюдалось появление антител к вирусу, а у добро