Научное приборостроение, 2020, том 30, № 4
научный журнал
Покупка
Тематика:
Приборостроение. Биомедицинская техника
Издательство:
Институт аналитического приборостроения РАН
Наименование: Научное приборостроение
Год издания: 2020
Кол-во страниц: 118
Дополнительно
Тематика:
ББК:
УДК:
ГРНТИ:
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
ISSN 0868–5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4, c. 3–20 ПРИБОРОСТРОЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ 3 УДК 543.07, 543.08 А. Г. Бородинов, В. В. Манойлов, И. В. Заруцкий, А. И. Петров, В. Е. Курочкин, 2020 ПОКОЛЕНИЯ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК (ОБЗОР) C момента разработки Фредериком Сэнгером и его коллегами революционного метода секвенирования ДНК прошло несколько десятилетий. Это исследование дало толчок усовершенствованию новых методов, которые открыли большие возможности для недорогого и быстрого секвенирования ДНК. После проекта "Геном человека" временной интервал между технологиями секвенирования начал сокращаться, в то время как объем научных знаний продолжал расти в геометрической прогрессии. Вслед за секвенированием Сэнгера, рассматриваемым как первое поколение, последовательно в практику были введены новые поколения секвенирования ДНК. Развитие технологий секвенирования следующего поколения (NGS) внесло существенный вклад в эту тенденцию за счет снижения затрат и получения массивных данных секвенирования. К настоящему времени выделяют три поколения технологий секвенирования. Секвенирование второго поколения, которое в настоящее время является наиболее часто используемой технологией NGS, состоит из этапов подготовки библиотеки, амплификации и секвенирования, в то время как при секвенировании третьего поколения отдельные нуклеиновые кислоты секвенируются напрямую, чтобы избежать систематических ошибок и иметь более высокую пропускную способность. Развитие новых поколений секвенирования позволило преодолеть ограничения традиционных методов секвенирования ДНК и нашло применение в широком спектре приложений молекулярной биологии. С другой стороны, с развитием технологий следующих поколений возникает множество технических проблем, которые необходимо глубоко анализировать и решать. Каждое поколение и платформа секвенирования в силу своего методологического подхода имеет характерные преимущества и недостатки, которые определяют пригодность для тех или иных приложений. Таким образом, оценка этих характеристик, ограничений и потенциальных приложений помогает сформировать направления дальнейших исследований технологий секвенирования. Кл. сл.: секвенирование нуклеиновых кислот, исследования генома, поколения технологий секвенирования ДНК, направления исследований технологий секвенирования ВВЕДЕНИЕ Секвенированием называют процесс определе ния точного порядка расположения нуклеотидов в молекуле ДНК. Открытия, сделанные в 70-х гг. прошлого века Сэнгером и Максамом – Гилбертом, позволили совершить революцию в мире биологических наук, сделав секвенирование рабочим инструментом для большого количества исследователей в биологии, медицине, криминалистике и т.д. За последние 40 лет секвенирование ДНК значительно продвинулось с точки зрения приборного оснащения, инструментов и методик секвенирования. Современные методы дают возможность расширить диапазон применений, повысить точность, производительность и надежность секвенирования. Доступность секвенирования привела к значительному увеличению объема знаний о различных биологических объектах. Полученная информация наполняет базы данных, дос тупные для широкого круга исследователей по всему миру. Сегодня исследователи и специалисты из различных областей используют эти данные для многих целей, включая обеспечение продовольственной безопасности путем улучшения качества и урожайности сельскохозяйственных культур, животноводства, улучшения диагностики, прогнозирования и лечения многих сложных заболеваний, прогресса в криминалистке и т.д. В серии статей предполагается рассмотреть ме тоды секвенирования ДНК в трех аспектах: технологическая история разных поколений секвенирования, протоколы данных и инструменты биоинформатики. В данной статье рассмотрена технологическая история от секвенирования первого поколения (first generation sequencing (FGS)) до секвенирования третьего поколения (third generation sequencing (TGS)).
А. Г. БОРОДИНОВ, В. В. МАНОЙЛОВ, И. В. ЗАРУЦКИЙ, А. И. ПЕТРОВ, В. Е. КУРОЧКИН НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 4 1. ПОКОЛЕНИЯ СЕКВЕНАТОРОВ ДНК Секвенирование ДНК — экспериментальный метод определения последовательного расположения оснований нуклеиновых кислот (A, T, G и C) в полинуклеотиде, кодирующем различные белки, которые функционируют в живой клетке. Полный набор кодирующих и некодирующих последовательностей в ДНК человека называется геномом. Геном несет информацию обо всех белках, необходимых для нормальной жизни организма. Биологические последовательности показывают сложные образцы сходства друг с другом. Это можно определить путем поиска сходства между последовательностями. Для этого нам нужно знать всю геномную последовательность организма. Технологии метода химической деградации, предложенные Максамом и Гилбертом, метод дидезокси-терминации цепи, разработанный командой Sanger в 1977 г., и автоматическое секвенирование с помеченной флуоресценцией в 1990-х гг. вместе сформировали первое поколение секвенирования (FGS). Благодаря своей сравнительной простоте метод Сэнгера стал доминирующим методом в FGS. Секвенирование Сэнгера позволило секвенировать бактериофаг PhiX 174, который содержит приблизительно 5375 нуклеотидов. Это исследование стало первым полностью секвенированным геномом в 1977 г. В 2003 г. международный проект консорциума "Геном человека" (HGP) успешно секвенировал и картировал весь геном человека, который завершился после 13 лет исследований во многих лабораториях мира. Секвенирование второго поколения (SGS) или секвенирование следующего поколения (NGS) относится к высокопроизводительным технологиям секвенирования ДНК, которые могут секвенировать миллионы или миллиарды нитей ДНК. При этом процесс определения последовательности происходит с использованием ферментативной репликации или амплификации, обеспечивающей значительную пропускную способность и многократное секвенирование целевых областей. Секвенирование третьего поколения (TGS) ха рактеризуется путем добавления нуклеотидов по одному для получения длинных и точных результатов секвенирования, в то время как технология амплификации не используется. Одноклеточное секвенирование также характерно для технологии TGS. 2. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ Конец 1970-х и 1980-е гг. были значительным периодом для генетики и геномики. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделало воз можной амплификацию ДНК и разработку первых технологий секвенирования ДНК, секвенирующих весь геном. Секвенирование Сэнгера и секвенирование Максама – Гилберта, рассматриваемые как методы секвенирования первого поколения, доминировали в геномике в течение почти 40 лет. Они проложили путь для последующих технологий секвенирования. 2.1 Максам – Гилберт секвенирование 2.1.1. История Максам – Гилберт (Maxam – Gilbert) [1, 2] сек венирование — одна из самых ранних платформ секвенирования ДНК. Этот метод секвенирования широко известен как метод химического расщепления. Он был разработан в 1977 г. Алланом Максамом, студентом в Гарвардском университете, вместе с Уолтером Гилбертом и основан на нуклеотид-специфичной химической деградации при обработке ДНК различными химическими агентами. Метод утратил актуальность из-за своей технической сложности. 2.1.2. Принцип В 1976 г. А. Максам и В. Гилберт разработали метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, меченного с одного конца (рис. 1). Метод секвенирования ДНК путем химической деградации основан на ограниченном расщеплении меченного фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Обязательным условием секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только на одном конце. Разделение продуктов деградации по размеру с помощью высоковольтного электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения, способного разделять фрагменты ДНК, длина которых различается только на один нуклеотид, и последующая радиоавтография геля позволяет определить нуклеотидную последовательность ДНК. Первым шагом в проведении реакции химиче ской деградации является ограниченная модификация определенных нуклеотидов различными химическими агентами. Концентрация агента и продолжительность его действия на молекулы ДНК подбираются таким образом, чтобы в каждой молекуле модифицировался только один нуклеотид. Для каждого типа нуклеотидов или их комбинации проводят отдельные реакции ограниченной модификации и количественного расщепления. Таким образом, в результате последовательности реакций образуется смесь молекул олигонуклеотидов, различающихся по размеру на один нуклеотид и несущих на одном из концов метку (обычно радиоактивную).
ПОКОЛЕНИЯ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 5 Помимо меченых молекул в реакционной смеси будут присутствовать и олигонуклеотидные фрагменты, не несущие меток, но на этапе радиоавтографии они окажутся невидимыми. После разделения продуктов реакции в соседних дорожках секвенирования денатурирующего полиакриламидного геля и этапа радиоавтографии на рентгеновской пленке будет видна лестница из полос ДНК, считывание которой позволяет восстановить нуклеотидную последовательность ДНК. 2.1.3. Преимущества и недостатки Основная привлекательность процедуры секве нирования Максама – Гилберта заключается в том, что матрица ДНК, используемая в этом методе, может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Метод Максама – Гилберта был предпочтительнее метода Сэнгера в определенный момент времени, потому что метод Сэнгера требовал клонирования одноцепочечной ДНК для каждого начала считы вания. Метод Максама – Гилберта также можно использовать для анализа взаимодействия ДНКбелка и эпигенетических модификаций ДНК. Основным ограничением в секвенировании Максама – Гилберта стало использование вредных химических веществ и таких методов, как рентгеновское излучение и радиоактивные метки. Трудность в расширении и использовании этих методов, а также необходимость использования гидразина, известного нейротоксина, сделали метод невыгодным и практически мало применимым в процессе дальнейшего развития технологий. 2.2. Метод секвенирования по Сэнгеру 2.2.1. История Секвенирование по Сэнгеру [4–6] является од ним из первых методов секвенирования ДНК. Фредерик Сэнгер вместе со своими коллегами начал свои исследования по разработке технологии секвенирования с инсулина, затем РНК, а затем и ДНК. Его исследования проложили путь к методу секвенирования, или прерывания цепи Сэнгера, в 1977 г. В 1980 г. Сэнгер получил свою вторую Нобелевскую премию по химии, что сделало его одним из двух Нобелевских лауреатов, дважды получивших ее в одной и той же категории. Технология была коммерциализирована компанией Applied Biosystems. Это был метод, используемый для секвенирования всей человеческой ДНК в проекте "Геном человека" на базе сотен секвенаторов Sanger во многих лабораториях мира. 2.2.2. Принцип Химическая реакция проводится в четырех от дельных реакционных пробирках, каждая из которых содержит матричную ДНК, праймеры, ДНКполимеразу и четыре dNTP, один из которых радиоактивно помечен. Образец ДНК делится на четыре отдельные реакции секвенирования, содержащие все четыре стандартных дезоксинуклеотида (dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и ДНК-полимеразу. К каждой реакции добавляется только один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP), в то время как другие добавленные нуклеотиды являются обычными. После денатурации и отжига праймера фермент ДНК-полимераза начинает добавлять dNTP во вновь синтезированную цепь ДНК, и, если ddNTP включается, реакция прекращается. Это приводит к раздельному сбору нитей ДНК разных размеров во всех четырех реакционных пробирках. Результат отдельной реакции затем помещают в отдельные лунки полиакриламидного геля. Радиоактивное пятно указывает на фрагменты ДНК с ddNTP, включенным в определенном положении. Нуклеотидная после Рис. 1. Максам – Гилберт секвенирование основано на специфическом расщеплении цепочки ДНК с получением различных меченых фрагментов ДНК по размеру [3]
А. Г. БОРОДИНОВ, В. В. МАНОЙЛОВ, И. В. ЗАРУЦКИЙ, А. И. ПЕТРОВ, В. Е. КУРОЧКИН НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 6 Рис. 2. Принципиальная схема секвенирования Sanger [7] довательность в разделяющем геле определяется снизу вверх, а нуклеотидная последовательность в разных полосах терминатора дает шаблон нуклеотидной последовательности (рис. 2). 2.2.3. Преимущества и недостатки Секвенирование Сэнгера помогло исследовате лям определить мутации и первопричину генетических заболеваний. Это лучший метод для идентификации коротких тандемных повторов и секвенирования отдельных генов. Однако самым большим недостатком этого метода является количество времени, которое он потребляет, что связано с низкой пропускной способностью. Метод может обрабатывать только относительно короткие последовательности ДНК (до 300–1000 пар оснований) одновременно. 2.3. Automated DNA Sequencing 2.3.1. История Оба метода: Сэнгера и Максама – Гилберта — были трудоемкими и сложными. В 1986 г. Leroy Hood и его коллеги усовершенствовали метод секвенирования Сэнгера, используя флуоресцентные метки вместо радиоактивных меток. Один из четырех флуоресцентных красителей используется для маркировки нуклеотидных праймеров. Каждый краситель используется в отдельной реакции секвенирования с одним из четырех ddNTP. По завершении реакций секвенирования все четыре реакции смешивают и анализируют вместе в одной полосе (lane) полиакриламидного геля. Использование четырех различных ddNTP, меченных
ПОКОЛЕНИЯ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 7 Рис. 3. Автоматическое секвенирование ДНК. а — система капиллярного электрофореза; б — лазерное обнаружение флуоресцентных меток; в — электрофореграмма последовательности ДНК [9] флуоресцентной меткой с четырьмя различными длинами волн, позволяет проводить реакцию секвенирования в одной пробирке вместо четырех отдельных реакций. Этот метод был усовершенствован в начале 1990-х гг., когда Harold Swerdlow и его коллеги использовали капилляры в методе секвенирования ДНК. Эти капилляры достаточно маленькие (с внутренним диаметром 50 мкм) и работают с более высокими напряжениями, чтобы уменьшить время работы. В 1993 г. B. L. Karger заменил полиакриламид разделительной матрицей с низкой вязкостью; позже, в 1995 г. Zhang разработал non-cross-linked полимер, который стабилен даже при 60 °C для получения высококачественной последовательности нуклеотидов. 2.3.2. Принцип Основные принципы этого метода секвениро вания похожи на секвенирование Сэнгера [8], но процедура автоматизирована, и реакции проводят в одной пробирке, содержащей все четыре дидезоксинуклеотидтрифосфата, каждый из которых использует четыре различных флуоресцентных красителя, излучающих свет на определенной длине волны. Генерируемые данные последовательности собираются и анализируются с использованием компьютера (рис. 3). 2.3.3. Преимущества и недостатки Автоматизированные секвенаторы ДНК доро ги, а также ими сложно секвенировать повторяющиеся участки последовательности. Несмотря на новые открытия секвенаторов следующего поколения, автоматическое секвенирование по Сэнгеру по-прежнему считается "золотым стандартом" из-за его точности и длины чтения. При этом для массового использования данный метод секвенирования медлен и дорог. 2.4. Пиросеквенирование 2.4.1. История Пиросеквенирование начало применяться в 1987 г. как метод, используемый для непрерывного мониторинга активности ДНК-полимеразы (Nyren, Lundin). В 1988 г. Edward Hyman продолжил работу по созданию метода секвенирования ДНК. В 1996 г. платформа пиросеквенирования была разработана Ronaghi et al. Спустя почти 10 лет, в 2005 г., Rothberg и его коллеги представили первый коммерческий секвенатор следующего поколения, доступный на основе подхода пиросеквенирования, сделанного в 1996 г. Позже 454 Life Sciences разработали параллельную версию пиросеквенирования, которая с тех пор была приобретена Roche Diagnostics. 2.4.2. Принцип Согласно этой технологии [10, 11], растворы четырех типов нуклеотидов добавляются последовательно в процессе секвенирования фрагментов ДНК и отмываются после каждой реакции. При включении очередного нуклеотида в синтезируемую комплементарную цепь на подготовленной а б в
А. Г. БОРОДИНОВ, В. В. МАНОЙЛОВ, И. В. ЗАРУЦКИЙ, А. И. ПЕТРОВ, В. Е. КУРОЧКИН НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 8 Рис. 4. Схема представляет рабочий принцип пиросеквенирования одноцепочечной ДНК-матрице происходит детекция высвобождающегося пирофосфата путем связывания его с белком люциферазой и получением светового сигнала в итоге. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, а последовательность нуклеотидов определяется по световым сигналам в виде пиков на пирограмме, интенсивность которых пропорциональна количеству встроенных в цепь ДНК нуклеотидов одного вида из очередной реакционной смеси (рис. 4). Основой модификации 454 Life Sciences яви лось использование эмульсионной ПЦР с одновременной параллельной подготовкой многих сотен тысяч фрагментов ДНК для их секвенирования (рис. 5). После проведения всех предварительных этапов пробоподготовки каждый из четырех видов нуклеотидов, смешанный с другими реактивами для пиросеквенирования, подается последовательно в проточную камеру, куда помещается подложка, имеющая несколько миллиардов лунок, заполненных микросферами (одна лунка — одна микросфера). Каждая микросфера содержит на своей поверхности после ПЦР многие сотни тысяч копий одного из исходных ДНК-фрагментов. Если в лунку попадает тип нуклеотидов, который комплементарен очередному нуклеотиду в достраиваемой одноцепочечной цепи матрицы ДНК, то полимераза встраивает эти нуклеотиды, что приводит через каскад реакций к высвобождению пирофосфата и генерации общего светового сигнала из лунки. 2.4.3. Преимущества и недостатки Основным преимуществом пиросеквенирования является существенная экономия времени, поэтому процедура может быть проделана в режиме реального времени. Метод экономически эффективен по сравнению с методами секвенирования терминации дидезоксинуклеотидных цепей и облегчает фазирование гаплотипов и идентификацию структурных генетических вариаций путем парного считывания, которые охватывают десятки килобаз последовательности геномной матрицы. Однако основным недостатком метода является наличие существенных ошибок смещения кадров (frameshift errors), которые приводят к систематическим ошибкам при чтении [13]. Также с помощью этого метода невозможно безошибочно секвенировать протяженные участки, состоящие из одного и того же нуклеотида. Метод позволяет получать лишь прочтения относительно небольшой длины. 3. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВТОРОГО ПОКОЛЕНИЯ Секвенирование Сэнгера используется в тече ние уже почти 30 лет после его открытия. Стоимость и затраты времени в процессе данной процедуры стали осознаваться большой проблемой. Следующая волна технологий секвенирования, известная как секвенирование второго поколения,
ПОКОЛЕНИЯ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 9 Рис. 5. Массовое параллельное пиросеквенирование Roche 454 [12] или секвенирование следующего поколения (NGS), появилась в середине 2000-х гг. и была направлена на снижение затрат, увеличение скорости и устранение необходимости в электрофорезе. 3.1. Секвенирование путем синтеза Illumina/Solexa 3.1.1. История Платформа Illumina/Solexa является детищем ученых Shankar Balasubramanian и David Klenerman из Кембриджского университета, кото рые внесли неоценимый вклад в первый проект генома человека. Оба они использовали свой проект по флуоресцентно-меченым красителям и синтезам комплиментарной цепи полимеразой для нового подхода к секвенированию, известному как секвенирование путем синтеза. Позже они основали компанию Solexa Inc (в июне 1998 г.). В 2004 г. Solexa приобрела технологию молекулярной кла
А. Г. БОРОДИНОВ, В. В. МАНОЙЛОВ, И. В. ЗАРУЦКИЙ, А. И. ПЕТРОВ, В. Е. КУРОЧКИН НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 10 стеризации от Manteia. В 2006 г. Solexa выпустила свой первый секвенсор, Genome Analyzer, который революционизировал секвенирование ДНК, позволив секвенировать 1 гигабазу данных за один запуск прибора. Solexa была приобретена Illumina в 2007 г., и с тех пор платформа Illumina/Solexa остается одним из самых передовых и широко распространенных методов технологии секвенирования в мире. 3.1.2. Принцип Платформа секвенирования с помощью синтеза (SBS) Illumina/Solexa основана на методе реверсивной терминации (reversible termination) [14–18]. Секвенирование Illumina путем синтеза состоит из четырех основных этапов: подготовка образца, генерация кластеров, секвенирование и анализ данных. Подготовка библиотеки. ДНК цепочка случайно фрагментируется (200–600 пар оснований) ферментом транспозазой. Затем следует лигирование адаптеров (P5 / P7) до 5′ и 3′ концов. В качестве альтернативы добавляются индексы из шести пар оснований, которые создают уникальный штрихкод для образца, позволяющий упорядочивать разные образцы одновременно. Фрагменты, лигированные адаптером, амплифицируют с помощью реакции ПЦР и затем очищают. Генерация кластеров. Образец загружают в проточную ячейку с газоном из двух типов олигозидов, которые дополняют последовательность адаптера P5 / P7 фрагментов ДНК. Каждый гибридизированный фрагмент ДНК присоединен к комплементарному олигозиду, и фермент ДНКполимераза создает комплементарную цепь. Двухцепочечная ДНК денатурируется, и исходный шаблон вымывается, в то время как новый фрагмент, который ковалентно присоединен к проточной ячейке, остается. SsDNA (одноцепочечная ДНК) образует мостик путем гибридизации с соседним комплементарным праймером и удлиняется с помощью полимеразы, что приводит к образованию двух цепочечного ДНК-мостика. Мост DsDNA денатурируется, и конечным результатом являются две нити SsDNA, ковалентно присоединенные к проточной ячейке. Цикл амплификации повторяется много раз. Аналогично, каждый фрагмент амплифицируется в отдельные клональные кластеры посредством мостиковой амплификации, оставляя кластер с однородной последовательностью ДНК (рис. 6) Секвенирование. После клональной амплификации обратная ssDNA отщепляется и вымывается, оставляя только прямую ssDNA, присоединенную к проточной клетке. Праймер отжигает переднюю нить и начинает добавлять флуоресцентно меченные ddNTP. Только одна базовая пара добавляется за один раз с помощью обратимого терминатора, который предотвращает множественные добавления за один раз. Когда основание включено и флуорофор возбуждается лазером, излучение регистрируется. Флуорофор отщепляется, а терминатор удаляется. Цикл повторяется до тех пор, пока прямая нить не будет полностью секвенирована, что и дает последовательное секвенирование. Анализ данных. Платформа секвенирования Illumina обеспечивают определение нуклеотидных последовательностей длиной в среднем 50–300 нуклеотидов, что намного короче, чем получаемые путем секвенирования по Сэнгеру, в результате секвенирования на платформах NGS создается огромный массив данных и возникает необходимость в автоматизации процесса обработки с помощью высокопроизводительной вычисли тельной техники. Процесс обработки данных включает следующие основные шаги: фильтрация последовательностей и коррекция ошибок, выравнивание и объединение, анализ результатов. 3.1.3. Преимущества и недостатки Одним из главных преимуществ технологии SBS является то, что со стандартными реагентами она позволяет секвенировать до 96 образцов за цикл работы. Также SBS технология имеет явное преимущество при секвенировании гомополимерных последовательностей по сравнению с 454 или Ion Torrent, поскольку позволяет включать один нуклеотид на реакцию. Существенным преимуществом технологии является возможность парноконцевого чтения последовательностей ДНК. Одним из основных ограничений технологии SBS остается ограничение длины чтения, особенно когда речь идет о задачах расшифровки последовательности de novo. Ошибки замещения из-за увеличения фонового шума в каждом цикле, смещение GC в ходе мостиковой амплификации также вносят известные ограничения данной технологии. К недостаткам можно отнести и высокую стоимость приборов данной технологии. 3.2. Секвенирование лигированием: ABI/Solid 3.2.1. История Секвенирование ABI путем лигирования и об наружения олигонуклеотидов (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection, SOLiD) — метод секвенирования, основанный на принципе лигирования с использованием ДНК-лигазы вместо ДНК-полимеразы. В 2008 г. SOLiD System заявила эту технологию как единственную технологию NGS с точностью прочтения > 99.94 %. Длина
ПОКОЛЕНИЯ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 11 чтения в технологии ABI/SOLiD составляет от 25 до 35. Примерно 40 миллионов прочтений (ридов) может быть секвенировано, и соответствующие выходные данные секвенирования составляют от 2 до 4 гигабаз. Впервые прибор вышел на рынок в 2007 г., выпуск приборов закончен в мае 2016 г. [19]. 3.2.2. Принцип Метод работает по принципу конструирования геномной библиотеки и лигирования с последующей реакцией секвенирования (рис. 7). Эта технология секвенирования применяет ДНК-лигазу вместо ДНК-полимеразы для секвенирования. Ге ном подвергается случайной фрагментации, а затем присоединяется к молекуле адаптера с последующим добавлением намагниченных гранул для клональной амплификации таким образом, чтобы только один фрагмент ДНК был доступен на поверхности магнитного шарика. Эмульсионная ПЦР используется для амплификации молекул ДНК, захваченных шариками. В этом методе используется эмульсионная ПЦР, после которой каждая из микросфер содержит на своей поверхности около миллиона копий одного из исходных фрагментов ДНК. Затем фрагменты ДНК денатурируются и модифицируются на 3'-конце, что позволяет миллиардам Рис. 6. Схема секвенирования SBS [14]
А. Г. БОРОДИНОВ, В. В. МАНОЙЛОВ, И. В. ЗАРУЦКИЙ, А. И. ПЕТРОВ, В. Е. КУРОЧКИН НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 4 12 Рис. 7. Принцип работы ABI/SOLID технологии [20] микросфер, покрытых фрагментами ДНК, ковалентно связываться с подложкой. После этого следует процесс циклического лигазного секвенирования. К матрице одноцепочечной ДНК прикрепляют праймер и добавляют синтезированные флуоресцентно меченные восьмичленные олигонуклеотидные зонды. После того, как один из зондов комплементарно свяжется с первыми пятью основаниями праймера на одноцепочечной матрице ДНК, лигаза связывает его с праймером. В этом