Лабораторный практикум по биохимии
Покупка
Год издания: 2018
Кол-во страниц: 79
Дополнительно
Вид издания:
Учебное пособие
Уровень образования:
ВО - Бакалавриат
ISBN: 978-5-8064-2623-0
Артикул: 745065.01.99
Доступ онлайн
В корзину
Учебное пособие предназначено для студентов факультетов химии и биологии. В нём представлены экспериментальные работы по темам «Белковые аминокислоты», «Пептиды и белки», «Углеводы», «Липиды», «Нуклеиновые кислоты», «Витамины» и «Ферменты». Подробные описания методик проведения этих работ, а также их относительная простота даёт возможность использования их на факультативных занятиях в школе.
Для эффективного освоения учебного материала в пособие включены вопросы и задания для актуализации знаний по соответствующим темам, самоконтроля и самостоятельной работы студентов.
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
Российский государственный педагогический университет им. А. И. Герцена Е. С. Остроглядов, Т. А. Новикова, И. Е. Ефремова ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ Учебное пособие Санкт-Петербург Издательство РГПУ им. А. И. Герцена 2018
УДК 577.1 ББК 24.73 O 78 Печатается по решению кафедры органической химии РГПУ им. А. И. Герцена Рецензенты: д-р хим. наук, проф. М. М. Зобачева (РГПУ им. А. И. Герцена), канд. хим. наук, доц. Т. П. Ефимова (РГПУ им. А. И. Герцена) Остроглядов Е. С., Новикова Т. А., Ефремова И. Е. O 78 Лабораторный практикум по биохимии: учебное пособие. — СПб.: Изд-во РГПУ им. А. И. Герцена, 2018. — 79 с. ISBN 978–5–8064–2623–0 Учебное пособие предназначено для студентов факультетов химии и биологии. В нём представлены экспериментальные работы по темам «Белковые аминокислоты», «Пептиды и белки», «Углеводы», «Липиды», «Нуклеиновые кислоты», «Витамины» и «Ферменты». Подробные описания методик проведения этих работ, а также их относительная простота даёт возможность использования их на факультативных занятиях в школе. Для эффективного освоения учебного материала в пособие включены вопросы и задания для актуализации знаний по соответствующим темам, самоконтроля и самостоятельной работы студентов. ISBN 978–5–8064–2623–0 УДК 577.1 ББК 24.73 © Е. С. Остроглядов, Т. А. Новикова, И. Е. Ефремова, 2018 © О. В. Гирдова, оформление обложки, 2018 © Издательство РГПУ им. А. И. Герцена, 2018
ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Правила работы в химической лаборатории, техника безопасно сти и оказание первой помощи при несчастных случаях .............................. 4 2. Белковые аминокислоты: методы идентификации и разделения................ 7 2.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Белковые амино кислоты»............................................................................................................ 7 2.2. Экспериментальная работа: качественные реакции на белко вые аминокислоты............................................................................................ 8 2.3. Экспериментальная работа: горизонтальный электрофорез белковых аминокислот на бумаге................................................................. 13 2.4. Экспериментальная работа: распределительная хроматография белковых аминокислот на бумаге................................................................. 19 3. Пептиды и белки: качественное обнаружение и методы осаждения............. 28 3.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Петиды и белки» ................. 28 3.2. Экспериментальная работа: качественное обнаружение пепти дов и белков..................................................................................................... 30 4. Углеводы: качественное обнаружение ............................................................... 38 4.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Углеводы»............................ 38 4.2. Экспериментальная работа: качественное обнаружение угле водов................................................................................................................. 39 5. Липиды: выделение и изучение их свойств .................................................... 43 5.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Липиды»............................... 43 5.2. Экспериментальная работа: выделение липидов и изучение их свойств ............................................................................................................. 44 6. Нуклеопротеины: выделение и определение состава.................................... 51 6.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Нуклеиновые кис лоты»................................................................................................................ 51 6.2. Экспериментальная работа: выделение нуклеопротеинов из дрожжей и определение их состава .............................................................. 52 7. Витамины: качественное определение............................................................. 57 7.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Витамины»........................... 57 7.2. Экспериментальная работа: качественные реакции на витамины .............. 58 8. Ферменты: качественное определение и изучение их свойств.................... 66 8.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Ферменты»........................... 66 8.2. Экспериментальная работа: качественные реакции на ферменты.............. 68 Рекомендуемая литература ........................................................................... 79
1. ПРАВИЛА РАБОТЫ В ХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ, ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ И ОКАЗАНИЕ ПЕРВОЙ ПОМОЩИ ПРИ НЕСЧАСТНЫХ СЛУЧАЯХ Выполнение практических занятий по биологической химии требу ет предварительной самостоятельной подготовки студентов. Каждый студент обязан внимательно ознакомиться с содержанием практического занятия, используя настоящее руководство, лекционные записи, учебные пособия и учебники. В тетради необходимо кратко законспектировать описание опыта, объяснить наблюдаемые явления и обязательно привести уравнения всех реакций. На занятии студенты совместно с преподавателем разбирают со держание опытов, а затем переходят к выполнению работы, проделывая каждый эксперимент индивидуально, или по двое (по указанию преподавателя). Результаты каждого опыта студенты обязаны показать преподавателю, дать необходимые объяснения и лишь затем вылить содержимое пробирок в склянку для сливов, либо в раковину, и приступить к выполнению следующего опыта. Выполняя опыты, каждый студент должен строго соблюдать сле дующие основные правила работы в химической лаборатории: 1) в лаборатории необходимо соблюдать чистоту, тишину, порядок и правила техники безопасности, которые подобно изложены в инструкции № 315 по технике безопасности кафедры органической химии; 2) каждый работающий должен знать, где в лаборатории находится аптечка и противопожарные средства; 3) категорически запрещается в лаборатории курить, принимать пищу, пить воду; 4) опыты нужно проводить только в чистой посуде и, завершив ра боту, необходимо вымыть её; 5) используя реактивы, надо поддерживать на полках и на местах общего пользования полный порядок, не перемещать склянки на другое место, закрывать их пробками; 6) в лаборатории ничего нельзя пробовать на вкус. При определе нии запаха нельзя глубоко вдыхать пары; 7) в процессе работы необходимо соблюдать аккуратность, следить, чтобы вещества не попадали на кожу лица и рук;
8) нагревая пробирку, не направлять её отверстие на себя и на дру гих окружающих; 9) запрещается бросать в раковину остатки карбида кальция, натрия, сливать вязкие жидкости и кислоты. Их сливают в специальную посуду; 10) работу с ядовитыми веществами (бромом) производить в вы тяжном шкафу; 11) нельзя перемешивать содержимое пробирки, закрывая её паль цем и встряхивая. Перемешивание веществ в пробирках достигается легким ударением пальцами по нижней части пробирки; 12) склянки с горючим и легко воспламеняющимися веществами нельзя ставить вблизи нагревательных приборов; 13) в случае вспышки горючих веществ в пробирке — не бросать ее, а закрыть чем-либо отверстие пробирки. Если горящая жидкость разлилась по поверхности стола, пола, то необходимо тотчас же очаг огня засыпать песком, накрыть асбестовым одеялом или воспользоваться огнетушителем; 14) при работе с натрием необходимо выполнять следующие пра вила: – маленький кусочек натрия вынуть из банки пинцетом, высушить от керосина фильтровальной бумагой, очистить скальпелем от корки и сейчас же вести в реакционную смесь, бумагу осторожно залить водой; – нельзя остатки натрия выбрасывать в раковину (возможен взрыв) или в ведро (возможен пожар). Остатки натрия помещают в специальную склянку; 15) работа с концентрированными кислотами требует максималь ного внимания и осторожности, особенно при нагревании, так как ожоги кислотами очень болезненны, долго заживают, кислоты разрушают одежду, обувь. Особенно нужно беречь глаза. Поэтому при работе с кислотами надо выполнять следующие пра вила: – концентрированные кислоты прибавлять небольшими порциями; – перемешивать смеси с кислотами нужно особенно осторожно, чтобы не разлетались брызги; При ожоге кислотами обожженное место следует немедленно про мыть большим количеством воды, а затем обработать нейтральным раствором бикарбоната натрия, сделать повязку с мазью от ожогов. В случае поражения глаз после оказания первой помощи немедленно обратиться к врачу;
16) при работе со щелочами не допускать попадания их на руки, лицо и одежду. Особенно беречь глаза! Щелочной ожог сразу же промыть струей воды, затем насыщенным раствором борной кислоты и сразу обратиться к врачу; 17) по окончании работы каждый студент должен убрать своё рабо чее место, вымыть посуду, привести в порядок реактивы. Качество уборки рабочих мест проверяет дежурный и сдаёт лабораторию лаборанту или преподавателю.
2. БЕЛКОВЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ: МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И РАЗДЕЛЕНИЯ 2.1. Вопросы для актуализации знаний по теме «Белковые аминокислоты» 1. Охарактеризуйте белковые аминокислоты (строение, оптическая активность, реакционная способность, амфотерность). 2. Как классифицируют белковые аминокислоты? 3. Приведите примеры аминокислот с алифатическими, ароматиче скими и гетероциклическими радикалами. 4. Приведите примеры аминокислот с неполярными радикалами. 5. Радикалы каких аминокислот при рН 7 имеют положительный заряд? 6. Какие аминокислоты называют незаменимыми? Приведите при меры. 7. На примере валина покажите, как влияет рН среды на ионизацию -аминокислот. 8. Приведите уравнения кислотно-основных равновесий для метио нина, аргинина и глутаминовой кислоты при различных рН. 9. Дайте определение изоэлектрической точке и рассчитайте её для фенилаланина, лизина и аспарагиновой кислоты. 10. Каким образом определяют величины рКа функциональных групп аминокислот? 11. С какими реагентами аминокислоты выступают в качестве нук леофилов? Приведите уравнения реакций с конкретными аминокислотами. 12. Назовите классы производных аминокислот по карбоксильной группе. Какими способами они могут быть получены? Приведите уравнения реакций с конкретными аминокислотами. 13. Чем обусловлена реакционная способность белковых амино кислот? 14. Приведите примеры реакций, которые используют для идентифи кации N-и C-концевых аминокислот при анализе структуры пептидов. 15. Приведите примеры реакций, которые используют для защиты и активации функциональных групп аминокислот в пептидном синтезе. 16. Каково поведение -аминокислот при нагревании? Охарактери зуйте строение и реакционную способность продуктов реакции.
2.2. Экспериментальная работа: качественные реакции на белковые аминокислоты Ранее многочисленные качественные цветные реакции на амино кислоты составляли основу анализа -аминокислот и белков. В настоящее время, когда исследования аминокислот и белков проводятся физико-химическими методами, многие качественные реакции всё же сохраняют своё значение и применяются для обнаружения, идентификации и количественного анализа аминокислот. Различают два типа качественных реакций: – универсальные реакции — реакции, позволяющие обнаруживать все -аминокислоты, так как они протекают за счет общих групп аминокислот (амино- и/или карбоксильной); – специфические реакции — реакции, которые дают возможность определить отдельные -аминокислоты, что обусловлено участием в этих реакциях радикала аминокислот. Реактивы и оборудование 1. Растворы аминокислот: глицин, пролин, тирозин, триптофан, ар гинин, гистидин, цистеин, нитрит натрия (5%-ный раствор), ледяная уксусная кислота, 1%-ный раствор нингидрина, 3%-ный раствор сульфата меди, 10%- и 20%-ные растворы гидроксида натрия, реактив Миллона, концентрированная серная кислота, п-диметиламинобензальдегид, спиртовой раствор -нафтола, раствор гипобромита натрия, 40%-ный раствор мочевины, 1%-ный раствор сульфаниловой кислоты, 5%-ный раствор соляной кислоты, 0,5%-ный раствор нитрита натрия, концентрированная азотная кислота, раствор ацетата свинца. 2. Пробирки, держатели, плитки, водяные бани. Порядок выполнения работы При подготовке к лабораторной работе следует изучить теоретиче ский материал по теме «Белковые аминокислоты» и выполнить задания для актуализации знаний, предложенные в методическом пособии. Перед выполнением экспериментальной работы необходимо подробно ознакомиться с предлагаемыми методиками проведения реакций и правилами техники безопасности. Экспериментальная работа состоит из двух этапов: – проведение качественных реакций на -аминокислоты; – выполнение контрольной задачи, связанной с определением ами нокислот в предложенных растворах.
Ход работы и результаты оформить в виде таблицы. Лабораторная работа № 1. Качественные реакции на белковые аминокислоты № опыта Название реакции и её краткое описание Уравнение реакции и условия её проведения Наблюдения и объяснение 2.2.1. Универсальные реакции 1. Реакция Ван-Слайка на первичную аминогруппу Аминокислоты, содержащие первичную аминогруппу, реагируют с азотистой кислотой с образованием неустойчивого диазосоединения, разлагающегося с выделением свободного азота и образованием гидроксикислот. Реакция применяется для количественного определения аминокислот по измерению объёма выделившегося газообразного азота. Выполнение работы. К 1 мл раствора глицина прилить равный объ ём 5%-ного раствора нитрита натрия и 0.5 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь взбалтывают и наблюдают выделение пузырьков азота. 2. Нингидриновая реакция -Аминокислоты, реагируя с нингидрином, подвергаются окисли тельному дезаминированию и одновременно декарбоксилированию. Образовавшийся аммиак затем реагирует с эквимолекулярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя синефиолетовый комплекс — пурпур Руэмана* — интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Некоторые аминокислоты не дают с нингидрином сине-фиолето вого окрашивания. Так, пролин и гидроксипролин, содержащие иминогруппы, образуют с нингидрином производные иного строения, окрашенные в жёлтый или оранжевый цвета. Серосодержащие аминокислоты с нингидрином образуют соединения, имеющие оранжево-бурую окраску. Реакция с нингидрином используется для обнаружения и точного определения небольших количеств аминокислот. При определенным образом подобранных условиях, интенсивность окраски можно исполь * Пурпур Руэмана или сине-фиолетовый Руэмана назван так по имени учё ного, открывшего эту реакцию в 1910 году.
зовать для колориметрического определения концентрации аминокислот, так как этот метод обладает очень высокой чувствительностью. Кроме того, количественные определения можно проводить и газометрически, измеряя объём выделившегося углекислого газа. Выполнение работы. В пробирку наливают 1 мл раствора глицина, в другую — 1 мл раствора пролина. В обе пробирки прибавляют по 0.5 мл 1%-ного раствора нингидрина. Содержимое пробирок нагревают на водяной бане несколько минут до появления окраски. В первой пробирке с раствором глицина появляется сине фиолетовое окрашивание, а во второй, с раствором пролина, ярко-жёлтое. 3. Образование комплексов с металлами -Аминокислоты образуют внутрикомплексные соли с катионами двухвалентных металлов. Самыми устойчивыми являются соли меди, образующиеся в результате взаимодействия аминокислот с гидроксидом меди (II). Комплексы представляют собой окрашенные в синий цвет хелатные соединения. Водные растворы таких комплексных солей, в отличие от растворов солей соответствующих металлов, обладают очень низкой электропроводностью. Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл 3%-ного раствора сульфата меди (II) и в каждую пробирку прибавляют несколько капель 10%-ного раствора гидроксида натрия до образования осадка. Затем в одну пробирку добавляют 0.5 мл концентрированного раствор глицина, во вторую — 0.5 мл раствора аргинина, а в третью — 0.5 мл раствора пролина. Сравнивают окраску образовавшихся комплексных солей. В пробирках с глицином и пролином окраска более насыщена по сравнению с раствором аргинина. 2.2.2. Специфические реакции 1. Реакция Миллона на тирозин Тирозин образует с реактивом Миллона (смесь нитратов одно- и двухвалентной ртути с примесью азотистой кислоты) кроваво-красный осадок, представляющий ртутную соль динитротирозина. Выполнение работы. К 1 мл концентрированного раствора тирози на прибавляют 0.5 мл реактива Миллона, перемешивают и нагревают до появления красного окрашивания. 2. Реакции на триптофан Реакции триптофана с альдегидами или альдегидокислотами в кислой среде приводят к образованию окрашенных продуктов конден
сации. Это качественные реакции на индольное кольцо триптофана, которое может быть обнаружено с помощью реакций Адамкевича (реагент — глиоксиловая кислота) и Эрлиха (реагент — п-диметиламинобензальдегид). а) Реакция Адамкевича на триптофан Взаимодействие триптофана с глиоксиловой кислотой, образую щейся при взаимодействии уксусной кислоты с концентрированной серной кислотой, приводит к образованию красно-фиолетового продукта. Выполнение работы. К 1 мл триптофана приливают 0.5 мл концен трированной уксусной кислоты, перемешивают и осторожно по стенке пробирки, наклонив её, приливают 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы не происходило смешения жидкостей. На границе двух слоёв через некоторое время появляется красно-фиолетовое окрашивание. б) Реакция Эрлиха на триптофан Реакция триптофана с п-диметиламинобензальдегидом в серной кислоте приводит к образованию окрашенного в фиолетовый цвет продукта конденсации. Выполнение работы. К 1 мл раствора триптофана приливают 0.5 мл раствора п-диметиламинобензальдегида в серной кислоте. Смесь нагревают до появления фиолетового окрашивания. 3. Реакция Сакагучи на аргинин Эта реакция применяется для идентификации гуанидиновой груп пировки аргинина. При взаимодействием с -нафтолом в присутствии окислителя в щелочной среде гуанидины дают соединения, окрашенные в красный цвет. Аргинин, реагируя с -нафтолом и гипобромидом натрия, образует продукт конденсации оранжево-красного цвета. Выполнение работы. К 1 мл раствора аргинина прибавляют 3 капли 10%-ного раствора гидроксида натрия и 2 капли спиртового раствора -нафтола. Хорошо перемешивают, прибавляют 2 капли раствора гипобромита натрия и снова перемешивают. Для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания приливают 0.5 мл 40%-ного раствора мочевины. 4. Реакция Паули на гистидин Гистидин в щелочной среде реагирует с бензолсульфокислотой с образованием производного вишнёво-красного цвета. Диазобензолсульфокислота образуется при диазотировании сульфаниловой кислоты. Взаимодействие диазобензолсульфокислоты с гистидином приво дит к образованию азосоединения.
Доступ онлайн
В корзину