Применение методов микроскопии и инфракрасной спектрометрии для оценки переваримости кормов

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации 

Департамент научно-технологической политики и образования 

Федеральное государственное бюджетное образовательное 

учреждение высшего образования 

«Волгоградский государственный аграрный университет» 

С.О. Бибиков, Р.К. Пономаренко 
Е.В. Корнилова, С.О. Шаповалов 
С.И. Николаев, В.В. Шкаленко 

Е.А. Морозова 

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МИКРОСКОПИИ И 

ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ 

ДЛЯ ОЦЕНКИ ПЕРЕВАРИМОСТИ КОРМОВ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

Волгоград 

Волгоградский ГАУ 

2019 

УДК 635.085.25
ББК 45.451
П-76

Рецензент –

ветеринарный врач  ООО «Мегамикс» Краснооктябрьского района   
города Волгограда Е.В. Землянов

П-76 – Применение методов микроскопии и инфракрасной спектрометрии 
для 
оценки 
переваримости 
кормов: 
учебно
методическое пособие / С. О. Бибиков, Р. К. Пономаренко, Е. В. Корнилова, С. О. Шаповалов, С. И. Николаев, В. В Шкаленко, Е.А. Морозова. – Волгоград: ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ, 2019. – 68 с. 

В учебно-методическом пособии показано значение исследова
ний фекалий методами инфракрасной спектроскопии и микроскопии 
для оценки переваримости кормов и диагностики различных заболеваний желудочно-кишечного тракта животных. Подробно описана методика исследования и показатели кала. Иллюстрированный материал 
позволяет идентифицировать результаты микроскопических исследований, методика построения калибровочных решений может послужить основой для построения аналогичных калибровочных уравнений.

Предназначено для научных сотрудников биологических, зоо
технических и ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских 
учреждений, опытных станций и сельхозпредприятий. Оно может
быть использовано аспирантами и студентами вузов биологического, 
ветеринарного и зоотехнического профилей в качестве лабораторного 
руководства.

УДК 635.085.25
ББК 45.451

© ФГБОУ ВО Волгоградский государственный аграрный университет, 2019 
© Авторы, 2019

АКТУАЛЬНОСТЬ 

В мировой литературе, посвященной идеологии нормирования 

физиологически обоснованного потребления эссенциальных нутриентов (энергии, белка, витаминов, микроэлементов), существуют различные системы дефиниций, нашедшее отражение в современных системах питания животных: NRC и CNCPS (США), AFRC (Великобритания), INRA (Франция), SCA (Австралия), DLG (Германия) и др.

В отечественной литературе до сих пор отсутствует точное 

дифференцирование понятий "Физиологическая потребность" в эссенциальном нутриенте и "рекомендуемая норма (уровень, величина, 
размер) потребления" этого вещества. Эти два понятия - "физиологическая потребность" и "рекомендуемая норма потребления» - при всем 
их тесной взаимосвязи, принципиально разные как по смыслу, который вкладывается в них, так и по методам их определения и количественном выражении. Смешивание этих понятий ведет не только к 
терминологической, но и смысловой путаницы, может служить причиной неправильных представлений и выводов. Именно поэтому во 
всей зарубежной литературе, как научной, так и официальной, прослеживается четкое разграничение терминов "requirement (needs)" и 
"recommended allowances (intakes)".

Исследование кормов, используемых для кормления животных 

не является сложной задачей. Более веской проблемой является задача 
оценки потребности животных в энергии, белке, биологически активных веществах. Повсеместное использование информационных технологий и развитие многомерных статистических процедур в области 
хемометрики привело к увеличению использования методов инфракрасной спектроскопии (NIRS) в качестве альтернативы к традиционным аналитическим методам определения энергетической и биологической ценности кормов.

Своевременное принятие решений по корректировке рациона

сельскохозяйственных животных на основе результатов инфракрасного анализа позволяет эффективно поддерживать рентабельность производства продукции животноводства.

Lyons R. K. в 1992 и Leite E. R., Stuth J. W. В 1994 году показали 

возможности применения инфракрасного анализа для оценки переваримости кормов для животных по химическому составу кала. Образцы кала анализировались на содержание сырого протеина (СП) и органического вещества (ОВ). Результаты исследований показали, что 
образцы кала могут быть использованы для прогнозирования усвояемости СП и ОВ.

В 1997 году Neumeister V. et al. было установлено, что приме
нение инфракрасного анализа можно использовать для диагностирования мальабсорбции и анализа эффективности лечения поджелудочной железы.

В тоже время, копрологическое исследование в совокупности с 

другими методами диагностики, в том числе и инфракрасный анализ,
позволяет подтвердить и/или установить патологии желудочнокишечного тракта и развитие заболеваний, оценить процессы переваривания корма.

В дополнение к описанным интегральным исследовательским 

методам копрологии микроскопические методы дают возможность 
определить переваривание трех основных элементов корма: белков, 
жиров и углеводов. 

Данные тенденции описаны в современных работах. Fine K. D. и 

Ogunji F. A в 2002 году разработали микроскопический метод количественного определения содержания жира в кале с помощью окрашивания Суданом III. 

В 2015 году Мусаев Ф. А. и Захаров Л. М. использовали микро
скопический метод анализа кала для определения влияния скармливания кукурузного глютена крупному рогатому скоту. В своих исследованиях они изучали степень усвояемости рациона по количеству в кале крахмала и жира.

Применение инфракрасной спектроскопии в комплексе с микро
скопией для оценки переваримости кормов по химическому составу 
позволяет в кратчайшие сроки получить сведения о переваримости 
кормов и физиологической возможности животных усваивать данные 
питательные вещества.

ОТБОР ПРОБ

Фекалии отбирают стерильной одноразовой лопаточкой, проки
пяченным резиновым катетером или скальпелем в одноразовые стерильные флаконы в момент естественной дефекации или непосредственно из прямой кишки включая в пробу комочки слизи, обрывки 
слизистой оболочки, кровянистые прожилки. Они должны быть без 
примеси мочи, влагалищных выделений и т. д. обязательно описывают внешний вид кала и указывают его количество.

Кал желательно исследовать сразу после взятия. Образцы на
тивных фекалий хранят при температуре 2-8ºС в течение суток, не допускается замораживание нативных проб фекалий. Фекальную суспензию с глицерином и осветленный фекальный экстракт хранят при 
температуре минус 200 Сº – в течение 1 недели, при температуре минус 700 Сº – длительно. Консервированная фекальная суспензия может быть использована только для исследования ПЦР методом.

МАКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 

При макроскопических исследованиях определяют количество, 

консистенцию, форму, цвет, запах, наличие примесей.

Количество выделенного кала за одну дефекацию зависит от ви
да и возраста животного, объема и особенностей корма, состояния органов пищеварения. Количество кала увеличивается при усилении перистальтики кишечника, уменьшением всасывающей способности 
стенок кишечника (мальабсорбция), воспалительной экссудацией и 
быстрым прохождением формирующихся каловых масс. Уменьшение 
количества может наступить при малом употреблении корма, запорах.

Консистенция и форма кала зависит от содержания в нем воды и 

функции кишечника. При гипотониях кишечника с замедленной перистальтикой и повышенной всасываемостью кал становится сухой и 
мелкий. При условиях усиленной перистальтики и уменьшения всасывания воды кал становится жидкий и бесформенный. Также форма 
кала зависит от вида и возраста животного. У новорожденного молодняка кал (меконий) имеет неоформленную кашицеобразную форму.

Цвет кала зависит от множества факторов: вид и состав корма, 

наличие примесей, присутствие желчных пигментов. Лекарственные 
средства также могут влиять на цвет. При нарушении работы печени и 
связанным с этим уменьшением количества желчи кал становится серовато-глинистого цвета. Выделение крови в просвет ЖКТ придает 
окраску от темно-коричневой до черной. При воспалительном процессе кал становится сероватого, землистого цвета.

Запах кала у каждого вида животного специфический. Запах ка
ла обусловлен продуктами распада белковых веществ: индол, скатол, 
жирные кислоты. Белковая составляющая корма придает сероводородный запах. Корма животного происхождения дают более резкий 
запах по сравнению с растительными. С диагностической точки зрения запах имеет значение при различных патологиях желудочнокишечного тракта. При гнилостных процессах появляется запах гнили, бродильные процессы дают кислый запах. 

Примеси могут быть различного характера. Слизь в кале посто
янна, но большое ее количество свидетельствует о воспалительных 
процессах в кишечнике. Неизмененная кровь появляется в кале при 
поражении слизистого и мышечного слоев толстого кишечника. 
Кровь, поступившая в просвет кишечника из более отдаленных участков, успевает претерпеть изменения и потерять характерный цвет. В 
кале могут быть обнаружены примеси не естественного характера: песок, полимерные пленки, ткань и т. д., что может говорить о загрязненности корма или быть следствием извращенного аппетита. Боль

шое количество газа придает фекалиям пенистый вид. Гной отмечают 
при язвенных поражениях или при вскрытии абсцессов. Обнаружение 
кишечных паразитов при осмотре имеет большое диагностическое 
значение.

Таблица 1 – Копрограмма здоровых животных 

Показатели

Крупный
рогатый 

скот

Мелкий
рогатый

скот

Лошади
Свиньи
Собаки

1
2
3
4
5
6

Консистенция

Кашицеоб
разная
плотная
плотная
мягкая
Плотновато 

мягкая

Форма
лепешка

Продолговато
овальные 
шарики

продолго

вато
овольные
скибалы

цилиндры
цилиндры

Цвет

зеленоватого цвета с различными

оттенками, от желто-бурого до
бурого с сероватым оттенком

глинистожелтый,
буроватозеленый

темно
коричневый

Запах
Кисловатый
зловонный, слабокислый, гнилостный

рН
нейтральна, слабокислая
Нейтральная, 
слабощелочная

Таблица 2 – Остатки непереваренных элементов корма в кале

Показатели
Нормативы

1
2

Переваримая клетчатка
отсутствует

Непереваримая клетчатка
в умеренном количестве

Мыщечные волокна
В незначительном количестве

Жир и жирные кислоты
В незначительном количестве

Примеси: песок 

конкременты 

безоары 

инородные тела 

слизь 
кровь
гной 

пузырьки газов 

бактерии 

яйца гельминтов 

кишечные паразиты

Отстутствует
Отсутствует
Отсутствует 
Отсутствует

В незначительном количестве

Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует

В незначительном количестве

Отсутствует
Отсутствует

ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 

Устанавливают реакцию кала (рН), наличие скрытой крови, 

желчных пигментов, белковую экссудацию, активность энтерокиназы 
и щелочной фосфотазы.

Определение реакции кала

Определение производят с помощью лакмусовой или индика
торной бумаги, а лучше с помощью рН-метра. При использовании 
универсальной индикаторной бумаги реакцию определяют по цветной 
шкале, снабженной цифровыми обозначениями рН.

Наиболее точно реакцию фекалий можно определить с помо
щью рН-метра. Для этого кал необходимо развести дистиллированной 
водой в соотношении 1:10.

Реакция кала обусловлена жизнедеятельностью кишечной мик
рофлоры. У травоядных животных в норме нейтральная или слабокислая реакция кала, а у плотоядных- нейтральная или слабощелочная. Изменение реакции связано с соотношением бродильных и гнилостных процессов в кишечнике. Бродильные процессы сопровождаются активизацией йодофильной микрофлоры, которая продуцирует 
диоксид углерода и органические кислоты, что мсещает реакцию кала 
в сторону кислой. Активация гнилостной микрофлоры придает калу 
щелочную реакцию за счет повышенного образования аммиака. 

По содержанию в кале органических кислот и аммиака можно 

судить о преобладании гнилостных или бродильных процессов. При 
увеличении бродильных процессов увеличивается содержание органических кислот, при усиленном гниении белка в кишечнике возрастает содержание аммиака в кале.

Определение органических кислот 

(«молочной, маслиной, уксусной, пропионовой, валериановой и др.)

Реактивы:

30 % водный раствор полутора хлористого железа; 
1 % спиртовой раствор фенолфталеина; 
раствор гидрата окиси кальция; 
0,1 Н раствор соляной кислоты; 
0,5 % спиртовой раствор метилового красного.

Ход определения:

10 г фекалий, размешивают в 100 мл дистиллированной воды, 

прибавляют I мл 30% раствора полутора хлористого железа, 25 – 30 
капель спиртового раствора фенолфталеина и 2 мл гидрата окиси 
кальция, хорошо перемешивают. Жидкость окрашивается в красный 
цвет. После 20 - 30 минутного отстаивания смесь фильтруют через 

бумажный фильтр. В колбу отмеривают 25 мл фильтрата, прибавляют 
10-15 капель 0,5% спиртового раствора метилового красного до появления слабо - розового окрашивания. Затем титруют из бюретки 0,1 Н 
раствором соляной кислоты до перехода в оранжевый цвет. Количество миллилитров 0,1 Н раствора соляной кислоты, пошедшее на титрование, умножают на коэффициент 4, что и будет соответствовать 
количеству органических кислот в 10 г кала.

Определение аммиака 

Реактивы:

1 % спиртовой раствор фенолфталеина;
0,1 Н раствор едкого натра;
формалин.

Ход определения:

Для исследования на аммиак кал берут из прямой кишки. 10 г ка
ла заливают 100 мл дистиллированной воды, хорошо смешивают и 
фильтруют через бумажный фильтр. Затем к 25 мл фильтрата добавляют 5 – 10 капель 1% спиртового раствора фенолфталеина и титруют из 
бюретки 0,1 н раствором едкого натра до появления розового окрашивания. Количество израсходованной на титрование щелочи умножают 
на 4; полученное число соответствует содержанию аммиака в 10 г кала.

Определение крови и билирубина 

Данный тест особенно важен, когда имеется подозрение на нали
чие скрытой крови, которую не удается выявить при макроскопическом 
и микроскопическом исследованиях. Применяют следующие пробы. 

Бензидиновая проба

На предметное стекло наносят фекалии толстым слоем, добав
ляют 2-3 капли свежеприготовленного раствора бензидина в уксусной 
кислоте (берут на кончик ножа небольшое количество бензидина и 
растворяют в 5 мл ледяной уксусной кислоты) и столько же 3 % перекиси водорода, перемешивают стеклянной палочкой. При положительной реакции на кровь появляется сине-зеленое окрашивание в течение первых 2 мин. Окрашивание, появившееся после 2 мин не учитывают. Проба выявляет незначительное содержание крови (0,2%) в 
фекалиях.
Проба на стеркобилин с уксуснокислым цинком (по Шлезингеру)

Комочек кала помещают в пропорции 1:10 в дистиллированную 

воду и добавляют равное количество реактива Шлезингера (10 г ацетата цинка, растворенного в 90 мл 96 % этилового спирта) и несколько 
капель раствора Люголя. Полученную смесь фильтруют и полученный 
фильтрат просматривают на черном фоне, отмечаю зеленую флюоресценцию.

Проба на билирубин (по Фуше)

Комочек фекалий растирают с дистиллированной водой в соот
ношении 1:20 и добавляют по каплям реактив Фуше (25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 10 мл 10 % раствора полуторахлористого, или хлорного железа) в количестве, не превышающем объем эмульсии. В присутствии 
билирубина появляется зеленое или синее окрашивание.
Определение белковой экссудации по методу Трибуле – Вишнякова

Готовят 3%-ную эмульсию кала (3 г фекалий с 100 мл дистил
лированной воды, растирают в ступке). В 3 пробирки разливают 
эмульсию по 15 мл. В первую пробирку наливают 2 мл насыщенного 
раствора сулемы (7 г сулемы растворяют в 100 мл дистиллированной 
воды при нагревании) или 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, 
во вторую - 2 мл 20 % раствора уксусной кислоты и в третью, контрольную, - 2 мл дистиллированной воды. Пробирки встряхивают и 
оставляют при комнатной температуре на 24 ч. По истечению времени 
отмечают степень просветления жидкости над осадком, сравнивая с 
контрольной пробиркой. Учет реакции и ее оценка таковы: полное 
просветление (+++++) - реакция резко положительная, значительное 
просветление (+++) - реакция положительная; незначительное просветление (+) - реакция слабоположительная и одинаковое с контролем помутнение — реакция отрицательная. 

По реакции в пробирке с раствором сулемы можно судить о со
держании стеркобилина и билирубина. При наличии стеркобилина 
появляется розовое, а билирубина - зеленое окрашивание. В пробирке 
с трихлоруксусной кислотой при выявлении билирубина также получается зеленое окрашивание. Содержание стеркобилина и билирубина 
можно оценивать в пятибалльных плюсовых единицах. При этом минимальный балл (+) ставят, когда единичные частицы фекалий окрашены в зеленый (розовый) цвет, максимальный балл (+++++), когда 
весь кал имеет зеленый (кирпично-красный цвет). Отсутствие окрашивания обозначают знаком минус (-).

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 

Для микроскопического исследования кала готовят ряд препара
тов по различным методикам

Первый (нативный) препарат готовят следующим образом. На 

предметное стекло наносят 1—2 капли воды и растирают в ней с помощью стеклянной палочки небольшой комочек фекалий до получения равномерной эмульсии, которую покрывают покровным стеклом. 
После этого препарат исследуют под малым, потом под средним уве

личением микроскопа, в некоторых случаях и под иммерсией. В препарате при микроскопическом исследовании на фоне калового детрита обнаруживают остатки непереваренных белковых компонентов 
корма: соединительную ткань, мышечные волокна с исчерченностью и 
без исчерченности; переваримую и непереваримую клетчатку; остатки 
нерасщепленного и расщепленного жира; цилиндрический эпителий, 
эритроциты, а также яйца гельминтов, цисты простейших и их вегетативные особи.

Второй препарат готовят аналогичным образом, но комочек фе
калий растирают на предметном стекле не с водой, а с люголевским 
раствором двойной крепости. В таком препарате можно обнаружить 
крахмал, йодофильную микрофлору.

Третий препарат готовят в виде эмульсии смешиванием комочка 

фекалий на предметном стекле с реактивом Саатгофа (10 мл спирта, 
90 мл ледяной уксусной кислоты, Судана III для получения яркокрасной окраски). Этот препарат служит для обнаружения жира и 
продуктов его расщепления. Для дифференциации жировых элементов применяют также окраску препарата реактивом Гехта (смешивают 
перед употреблением равные объемы 1%-ного раствора нейтрального 
красного и 0,2%-ного раствора бриллиантового зеленого).

Четвертый препарат готовят из видимых примесей, если они 

есть (слизистые образования, пленки и др.).

До изучения первого препарата рекомендуется просмотреть 

препарат, изготовленный из комочка фекалий величиной с горошину, 
раздавленного до тонкого слоя между двумя предметными стеклами. 
В этом препарате сначала определяют количество кормовых остатков, 
состав которых зависит от отдельных компонентов корма и функционального состояния органов пищеварения, и также детрита.

Из остатков растительного корма в кале можно распознать рас
тительную клетчатку и крахмал. Различают два вида клетчатки переваримую и непереваримую. Переваримая клетчатка содержится 
во всяком растительном корме, она состоит из клеток, имеющих 
нежное строение и тонкую оболочку, а после переваривания крахмала 
от клеток остаются только слабые очертания. В кале здоровых животных переваримая клетчатка отсутствует или содержится в виде единичных клеток или клеточных групп, наличие большого количества 
переваримой клетчатки в кале свидетельствует о недостаточности 
пищеварения.

Непереваримая клетчатка под микроскопом распознается легко 

благодаря своим резким очертаниям, толстым двухконтурным оболочкам клеток, толстым межклеточным перегородкам.