Термодинамика комплексообразования лигандов с нуклеиновыми кислотами в водном растворе
Покупка
Основная коллекция
Издательство:
Вузовский учебник
Авторы:
Березняк Екатерина Германовна, Духопельников Евгений Владимирович, Гладковская Наталья Александровна, Хребтова Анна Сергеевна, Песина Дарина Александровна, Хорунжая Ольга Владимировна, Костюков Виктор Валентинович, Евстигнеев Максим Павлович
Год издания: 2019
Кол-во страниц: 166
Дополнительно
Вид издания:
Монография
Уровень образования:
Дополнительное профессиональное образование
ISBN: 978-5-9558-0417-0
Артикул: 334700.03.01
Монография посвящена термодинамическому анализу реакций нековалентного комплексообразования биологически активных молекул с нуклеиновыми кислотами. Основной акцент работы сделан на вопросах методологического характера, в частности рассмотрены теоретические модели, используемые в настоящее время, вычислительные алгоритмы анализа данных эксперимента и экспериментальные методы получения термодинамических параметров. Отдельное внимание уделено проблематике гидратации комплексов лигандов с НК и декомпозиции свободной энергии Гиббса на составляющие, ответственные за вклад различных физических факторов в энергетику комплексообразования.
Монография может быть полезна научным работникам, специализирующимся в области молекулярной биофизики и молекулярной биологии, а также студентам старших курсов высших учебных заведений, обучающимся по биофизическим и смежным направлениям подготовки.
Тематика:
ББК:
УДК:
ОКСО:
- ВО - Бакалавриат
- 03.03.03: Механика и математическое моделирование
- 14.03.01: Ядерная энергетика и теплофизика
- ВО - Магистратура
- 03.04.03: Радиофизика
- 14.04.01: Ядерная энергетика и теплофизика
ГРНТИ:
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
Термодинамика комплексообразования лигандов с нуклеиновыми кислоТами в водном расТворе Москва ВУЗОВСКИЙ УЧЕБНИК ИНФРА-М 201Севастопольский государственный университет МОНОГРАФИЯ
Термодинамика комплексообразования лигандов с нуклеиновыми кисло тами в водном растворе: монография. – М.: Вузовский учебник: ИНФРА-М, 2019. — 166 с. — (Научная книга). ISBN 978-5-9558-0417-0 (Вузовский учебник) ISBN 978-5-16-010655-7 (ИНФРА-М, print) ISBN 978-5-16-102668-7 (ИНФРА-М, online) Монография посвящена термодинамическому анализу реакций нековалент ного комплексообразования биологически активных молекул с нуклеиновыми кислотами. Основной акцент работы сделан на вопросах методологического характера, в частности рассмотрены теоретические модели, используемые в настоящее время, вычислительные алгоритмы анализа данных эксперимента и экспериментальные методы получения термодинамических параметров. Отдельное внимание уделено проблематике гидратации комплексов лигандов с НК и декомпозиции свободной энергии Гиббса на составляющие, ответственные за вклад различных физических факторов в энергетику комплексообразования. Монография может быть полезна научным работникам, специализирующим ся в области молекулярной биофизики и молекулярной биологии, а также студентам старших курсов высших учебных заведений, обучающимся по биофизическим и смежным направлениям подготовки. ББК 28.4 Т35 Данная работа была выполнена при частичной поддержке гранта Российского Научного Фонда (проект 14-14-00328) К о л л е к т и в а в т о р о в : Березняк Е.Г., Духопельников Е.В., Гладковская Н.А.,Хребтова А.С., Песина Д.А., Хорунжая О.В. Костюков В.В., Евстигнеев М.П. УДК 579.6(075.4) ББК 28.4 Т35 Подписано в печать 25.12.2014. Формат 60×90/16. Бумага офсетная Печать цифровая. Гарнитура Newton. Усл. печ. л. 10,375. Уч.-изд. л. 8,64 ПТ10. ТК 334700-497577-251214 Издательский Дом «Вузовский учебник» 127247, Москва, ул. С. Ковалевской, д. 1, стр. 52 www.vuzbook.ru ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М» 127282, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1 Тел.: (495) 280-15-96, 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29 E-mail: books@infra-m.ru http://www.infra-m.ru Отпечатано в типографии ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М» 127282, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1 © Вузовский учебник, 2015 ISBN 978-5-9558-0417-0 (Вузовский учебник) ISBN 978-5-16-010655-7 (ИНФРА-М, print) ISBN 978-5-16-102668-7 (ИНФРА-М, online) ФЗ № 436-ФЗ Издание не подлежит маркировке в соответствии с п.1 ч.2 ст.1
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ БАС – биологически активное соединение ВДВ – ван-дер-ваальсовы (взаимодействия) ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИК – инфракрасный ММ – молекулярная механика МД – молекулярная динамика НК – нуклеиновые кислоты НУПБ – нелинейное уравнение Пуассона-Больцмана РНК – рибонуклеиновая кислота РСА – рентгеноструктурный анализ УФ – ультрафиолетовая область спектра ЯМР – ядерный магнитный резонанс Act – актиноциновые антибиотики AMD – актиномицин D ARG – аргининамид BN – беренил CAF – кофеин CT – перенос заряда (charge transfer) DAPI – 4’-6-диамидино-2-фенилиндол DAU – дауномицин DM – дистамицин DOX – доксорубицин DSC – дифференциальная сканирующая калориметрия EB – бромистый этидий EL – эллиптицин FEP – возмущение свободной энергии (free energy perturbation) 3
FMN – флавин-мононуклеотид НТ – Hoechst33258 ITC – изотермическая титрующая калориметрия LUMO – наинизшая незанятая молекулярная орбиталь (highest unoccupied molecular orbital) MGB – лиганды, связывающиеся с малым желобком ДНК (minor groove binders) NMD – никотинамид NOE – ядерный эффект Оверхаузера (nuclear Overchauser effect) NT – нетропсин PDB – Protein Data Bank PF – профлавин PI – йодистый пропидий РМ – пентамидин PR – пропамидин SASA – площадь поверхности, доступной для растворителя (solvent-accessible surface area) ТРТ – топотекан 4
ВВЕДЕНИЕ Нуклеиновые кислоты (НК) присутствуют в клетках всех живых организмов и выполняют важнейшие функции по хранению, передаче и реализации наследственной информации. В силу огромной роли НК в живых организмах большое значение имеет разработка методов целенаправленного воздействия на них с целью достижения желаемого медико-биологического эффекта. Одним из наиболее эффективных способов реализации такого воздействия является связывание с НК биологически активных соединений (БАС), в частности, лекарственных препаратов. Медико-биологическое действие многих малых молекул (лигандов), прежде всего, антибиотиков и мутагенов, обусловлено их способностью образовывать нековалентные комплексы с молекулами НК в клетке с последующим нарушением и подавлением жизненно важных процессов – репликации, трансляции и транскрипции. Помимо структурных параметров, при анализе комплексообразования БАС и НК в водном растворе важную роль играет также термодинамика данного процесса. Знание термодинамического профиля комплексообразования БАС с НК необходимо для понимания механизма медико-биологического действия существующих препаратов и создания новых, более эффективных. Современное термодинамическое исследование реакций комплексообразования БАС с НК основывается на анализе экспериментально измеряемых изменений энергии Гиббса (∆G), энтальпии (∆H), энтропии (∆S) и теплоемкости (∆Cр). В связи с этим правильный подбор методов измерения этих параметров и понимание ограничений существующих методик численного анализа экспериментальных данных являются принципиально важными при последующей интерпретации термодинамических параметров в проекции на механизм взаимодействия того или иного препарата с НК. Также важно учитывать, что измеряемые в эксперименте параметры ∆G, ∆H, ∆S, ∆Cр образуются суммой вкладов различных физических факторов, каждый из которых, как правило, не может быть выделен в эксперименте отдельно, что вносит элемент неоднозначности в традиционную методику термодинамического анализа. Эти и многие другие актуальные проблемы составляют предмет рассмотрения настоящей монографии. 5
РАЗДЕЛ 1 СТРУКТУРНЫЕ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ С НК 1.1. Особенности структуры двойной спирали, определяющие основные закономерности взаимодействия лигандов с нуклеиновыми кислотами Нуклеиновые кислоты являются полимерами, состоящими из нуклеотидов, связанных в линейную последовательность фосфодиэфирными связями (рис. 1.1). а б Рис. 1.1. Схематическое изображение первичной структуры ДНК (а) и РНК (б). В состав нуклеотидов входят два вида азотистых оснований: пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин и тимин в ДНК или урацил в РНК). Сахар (дезоксирибоза в ДНК и рибоза в РНК) присутствует в виде фуранозного кольца, которое соединяется с одним из четырех гетероциклических оснований посредством β-гликозидной связи. Нуклеотид образуется в результате фосфорилирования 3’- или 5’гидроксильной группы сахара в составе нуклеозида. Последовательность нуклеотидов определяет первичную структуру НК [1]. 6
Дж.Уотсоном и Ф.Криком было показано [2], что ДНК представляет собой двойную спираль (рис. 1.2, а), в которой две полинуклеотидные нити связаны друг с другом посредством водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями. а б Рис. 1.2. Двойная спираль ДНК (а) и структура тРНК (б). Пространственная организация спирали ДНК с определенными геометрическими параметрами (шаг спирали, ее симметрия, поворот пар оснований вокруг оси, их наклон, число нуклеотидов на виток, и т.д) называется вторичной структурой или конформацией ДНК [3]. Между нитями находятся два желобка – большой (major groove) и малый (minor groove). Конформации НК достаточно разнообразны. В зависимости от внешних условий ДНК может существовать в многочисленных формах правых двойных спиралей (А, B, B', B', C, C', C'', D и Е). При высоком содержании противоионов, полностью экранирующих электростатическое поле фосфатных групп, возможно существование левоспиральной Z-ДНК [1, 3]. Кроме того, существует ряд других структур ДНК, таких как петли, шпильки, а также структуры более высокой организации – триплексы, 7
квадруплесы, i-мотивы и т.д. [4, 5]. При изменении внешних условий возможны как межсемейственные переходы, происходящие кооперативно с преодолением энергетического барьера из-за изменения конформации сахара, так и внутрисемейственные переходы [3]. В-ДНК является правозакрученной и содержит 10 пар оснований на один оборот спирали. А-ДНК также является правой, но по сравнению с Bформой, имеет более компактную форму (11 пар оснований на виток), ее нуклеотидная цепь наклонена вдоль продольной оси молекулы. Пары оснований смещены от оси спирали, поэтому А-форма ДНК имеет внутри полость («труба»). Z-ДНК образуется в основном CG парами оснований и является левозaкрученной зигзагоообразной спиралью, еще более компактной, чем А-форма (12 пар оснований на один оборот) [3]. Молекулы РНК имеют значительно более сложную и разнообразную структуру по сравнению с ДНК, что обусловлено их более многочисленными функциями в клетке [1]. Основным элементом всего многообразия форм РНК является шпилечная структура, состоящая из одноцепочечной петли, замкнутой двуспиральным участком – стеблем (рис. 1.2, б). При этом из-за наличия 2'-ОН группы у рибозы стебель шпильки РНК находится в А-форме, которая имеет глубокий и узкий большой желобок и неглубокий и широкий малый [6]. Другой особенностью РНК является часто встречающаяся некомплементарность и неправильное спаривание оснований. Это приводит к образованию внутренних петель (internal loops), выступов (bulges) и трехнитевых участков. Все эти неканонические структуры РНК могут являться участками узнавания для различных высокоспецифичных к ним лигандов [7]. Фрагмент РНК, содержащий такой участок, называется аптамером. Аптамер РНК является самостоятельным рецептором низкомолекулярных органических соединений и широко используется при изучении связывания лигандов с РНК in vitro, т.к. использование для этого всей молекулы РНК в целом крайне затруднительно [8]. Точное разбиение структур РНК и ДНК на большое число форм достаточно условно, так как имеют место многочисленные локальные структурные вариации, зависящие от конкретной последовательности пар оснований рассматриваемого участка двойной спирали. Биологические функции НК осуществляются за счет подвижности их спиральных структур, которая определяется не только гибкостью цепей, образованных ковалентно-связанными нуклеотидами, но и многочисленными внутри- и межмолекулярными взаимодействиями. Стабилизация пространственной структуры ДНК происходит, в основном, по двум механизмам [1]: 1. Образование межмолекулярных водородных связей между комплементарными основаниями различных цепей ДНК. При 8
правильном (уотсон-криковском) спаривании аденин и тимин связаны двумя, а гуанин и цитозин – тремя водородными связями (рис. 1.1). 2. Стэкинг-взаимодействия между плоскостями азотистых оснований, которые образуют «стопочную» структуру вдоль двойной спирали ДНК. Стэкинг обусловлен, в основном, ван-дер-ваальсовыми силами при взаимодействии между индуцированными диполями, образованными π-электронами оснований. Кроме того, располагаясь друг над другом, азотистые основания уменьшают контакт с молекулами воды, и гидрофобные взаимодействия дополнительно стабилизируют двойную спираль ДНК. Некоторые исследователи выделяют гидрофобные взаимодействия как отдельный вклад. Природа стэкингвзаимодействий до сих пор является предметом многочисленных исследований и дискуссий [1]. Кроме водородных связей и стэкинг-взаимодействий существуют также другие силы, стабилизирующие спиральную структуру НК. При физиологических значениях рН фосфатные группы заряжены отрицательно, что приводит к взаимному отталкиванию комплементарных цепей. В результате противодействия сил притяжения и отталкивания формируется вторичная структура, в которой при сохранении спаривания оснований фосфатные группы максимально удалены друг от друга. Таким образом, взаимное отталкивание фосфатных групп обуславливает закручивание спирали ДНК. Отрицательно заряженные фосфатные группы экранируются положительно заряженными ионами, находящимися в растворе. С ростом концентрации противоионов отталкивание между фосфатными группами уменьшается и стабильность НК возрастает [3]. Поскольку ДНК функционирует в водном окружении, важную роль в стабилизации ее структуры играет взаимодействие с молекулами воды за счет непосредственного образования водородных связей с гидратноактивными центрами ДНК, а также водных мостиков, которые формируют цепочки высоко упорядоченных молекул воды [9, 10]. Так, высокоупорядоченные молекулы воды обнаружены методом рентгеноструктурного анализа в минорном желобке В-ДНК [11, 12]. Также вода стабилизирует вторичную и третичную структуру ДНК, поскольку высокая диэлектрическая проницаемость воды ослабляет электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными фосфатными группами [3]. Определение соотношения сил, стабилизирующих структуру ДНК, стало предметом многочисленных исследований с момента установления пространственного строения этой молекулы [2, 13]. Долгое время считалось, что основной вклад в стабильность ДНК вносят водородные связи [14–16], однако в 80-х годах прошлого века это мнение было 9
подвергнуто сомнению [17, 18], что вызвало острую дискуссию [19, 20]. Появилось много теоретических и экспериментальных работ, направленных на определение вкладов стэкинг-взаимодействия и водородного связывания в стабильность дуплекса [21]. Согласно данным работы [22], основным фактором стабилизации структуры ДНК являются стэкинг-взаимодействия, при этом вклад водородного связывания для GC пар незначителен, а для AT пар вовсе является энергетически невыгодным. Тем не менее, водородные связи обуславливают комплементарность при образовании двойной спирали ДНК. Однако, определение вкладов разных типов взаимодействий в общую энергию стабилизации ДНК остается по-прежнему актуальным [23]. При рассмотрении взаимодействия лигандов с ДНК основное внимание уделяется связыванию с В-формой, поскольку именно в этом состоянии находится ДНК в волокнах при высокой относительной влажности и в водных растворах. Принято считать, что В-форма отвечает состоянию нативной ДНК в клетке. Для В-формы характерны глубокий и узкий малый желобок и широкий и неглубокий большой. В частности, поэтому большинство молекул лигандов связываются с молекулой В-ДНК путем укладки в малый желобок (minor groove binders, MGB - лиганды), а белки взаимодействуют с ней в основном со стороны большого [7]. Отметим, что некоторые биологически-активные соединения могут связываться и с большим желобком ДНК, но либо ковалентно, либо если она находится в А-форме [7]. При комплексообразовании БАС с ДНК в образовании водородных связей принимают участие потенциальные донорные и акцепторные группы как пар оснований, так и самого лиганда [24]. Также при взаимодействии ДНК и РНК с малыми молекулами важную роль играет стерическая и электростатическая комплементарность [25, 26]. 1.2. Типы комплексообразования лигандов с полинуклеотидными матрицами Известно, что многие БАС оказывают свое клиническое действие посредством взаимодействия с НК, вызывая тем самым ингибирование транскрипции и репликации [27–30]. Эти агенты используются при лечении бактериальных инфекций и различных онкологических, вирусных и инфекционных заболеваний. Тем не менее, наблюдаемая высокая токсичность препаратов снижает их терапевтический индекс, т.е. уменьшает соотношение между терапевтической и токсической дозой. Для целенаправленного создания новых лекарственных веществ с улучшенными свойствами необходимо понимание молекулярных основ 10