СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ                                                        3
10БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ                                          5
1.1 Биопленка или коллективное сообщество микроорганизмов 5 1.2«Чувство кворума» (Quorum Sensing)                           7
1.2.1 QS-Системы, использующие AI-2                            11
1.2.2 QS системы, основанные на действии ацилированных гомосеринлактонов (АГЛ)                                        13
1.3. Галогенизированные фураноны                               17
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ                                        24
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ                                          24
2.1 Объекты исследования                                       24
2.2 Используемые среды и реактивы                              24
2.3 Оборудование и материалы                                   26
2.4 Определение мутагенной активности методом микроядерного теста
(аннэугенный эффект)                                           26
2.5 Определение антиокислительной активности 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона                                                 29
2.6 Определение мутагенного эффекта на бактериальные клетки 30 2.7 Статистическая обработка данных                            31
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ                                     32
3.1 Цитотоксичность фуранона                                   32
3.2 Оценка генотоксичности мукохлорной кислоты             33
3.3 Анеугенный эффект 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона 36
3.4 Антиокислительная активность                               40
ВЫВОДЫ                                                         41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ                                              42

2

            ВВЕДЕНИЕ


      Колонизация и рост морских организмов на поверхностях других живых организмов (морские водоросли, беспозвоночные, и т.д.) может оказывать существенное негативное воздействие на организм хозяина. Это особенно имеет место для морских водорослей, поскольку они растут в освещенной зоне, где конкурентные давления является самыми высокими.
      Виды рода Delisea производят ряд уникальных естественных продуктов - галогенизированные фураноны или "фимбролиды", которые имеют интересные биологические свойства.
      В отличие от традиционных антибиотиков, фураноны запрещают формирование биопленки и другие фенотипы грамотрицательных бактерий при концентрациях, неингибирующих рост.
      Показано, что при нанесении на полимеры фураноны сохраняют антибактериальный эффект и не влияют на свойства самого полимера. Изучают возможность использования фуранонов для создания покрытий контактных линз. В одной из работ контактные линзы “замачивали” в растворе синтетического фуранона, но выводы исследования весьма неоднозначны. В другой опубликованной работе авторы использовали один из фуранонов для покрытия контактных линз и утверждают, что данный агент представляется перспективным в качестве антибактериального и антиакантамебного покрытия и безопасен в модельных исследованиях на животных.
      На сегодняшний день ученые из разных стран исследуют безопасность новых производных естественных фуранонов, нетоксичных для человека.
      Целью данной работы явилось изучение мутагенных свойств 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона, синтезированного Курбангалиевой

з

A. P., (кафедра органической химии, Химический институт им. А.М.Бутлерова, Казанский федеральный университет).


      Для этого решались следующие задачи:
      1.        Определить анэугенный эффект 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона методом микроядерного теста.
      2.        Оценить антиокислительную активность мукохлорной кислоты по системе Фентона.
      3.        Определить цитотоксичность и генотоксичность исследуемого нами фуранона на бактерии Salmonella typhimurium.

4

            ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ


            1.  1 Биопленка или коллективное сообщество
            микроорганизмов


      В конце XX века сформировалось представление об особой форме организации микрофлоры организма человека - хорошо организованном взаимодействующем сообществе микроорганизмов, покрывающих поверхности кишечной стенки, других слизистых оболочек, кожи и зубов сообщества. К представлению о единых сообществах микроорганизмов, обитающих в нашем теле, привели первоначально обнаруженные и описанные подобные формы сосуществования микробов в окружающей нас среде. Оказалось, что микробы, во-первых, предпочитают жить, будучи прикрепленными к твердой поверхности, нежели свободно плавающими - как в водной среде, так и в воздухе. Во-вторых, они организованы в так называемые биопленки (Biofilm), сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества. В природе биопленки распространены повсеместно. Также они выстилают нефтепроводы, аквариумы, постоянные катетеры, внутренние имплантаты, контактные линзы и протезы. Тонкое наслоение, формирующееся на зубах, - пример, хорошо знакомый каждому. Биопленки могут оказаться и очень опасными. Миллионы долларов ежегодно расходуются в мире на работы по контролю за подобными биопленками.
      Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания 99.9% бактерий в окружающей среде, поскольку в составе биопленки они защищены от антибактериальных препаратов, включая антибиотики, бактериофаги или фагоциты. Поэтому, нет ничего удивительного в том, что антибиотикотерапия и механизмы


5

естественной защиты макроорганизма (антитела и фагоциты) бессильны

перед такими инфекциями.

      Рисунок 1- Формирование биопленки
      Биопленки оказались высокоорганизованными бактериальными сообществами, в которых бактерии могут жить прикрепленными к поверхности. Они снабжены каналами для водоснабжения, для распределения питательных веществ между членами сообщества и удаления отходов жизнедеятельности клеток. Сравнение профилей экспрессии генов в клетках одних и тех же бактерий, существующих в составе биопленки или в планктонном свободном состоянии, показало, что разницу составляют около 45 дифференциально экспрессирующихся генов. Более того, было показано, что дифференциальная экспрессия генов наблюдается в разных местах биопленки. Это может свидетельствовать о выполнении индивидуальными членами бактериального сообщества разных

6

функций, что способствует повышению выживаемости всего сообщества.
      Структура биопленки и особенности физиологии составляющих ее клеток обеспечивают многократно повышенную по сравнению с аналогичными свободно живущими бактериями устойчивость членов сообщества к антимикробным препаратам, будь то антибиотики или факторы иммунной защиты макроорганизма.
      Предполагаемые механизмы такой устойчивости следующие:
      -      затрудненное и замедленное проникновение антимикробных агентов через полисахаридный матрикс биопленки;
      -      замедленная скорость роста бактерий в биопленке;
      -      бактерии используют межклеточные системы коммуникации, включая «чувство кворума», чтобы запускать разнообразные физиологические процессы, при которых бактериальные клетки приобретают резистентное состояние.
      Бактериальные популяции с высокой плотностью показывают уменьшенную чувствительность к обработке антибиотиками. Эта устойчивость была объяснена активацией генов стресс-ответа (Liu and Ferenci, 1998) или тем, что недостаток питательных веществ ведет к низкой метаболической активности и пониженной проницаемости клетки (Brown, Williams, 1985). Позже, Фукс и др. также предложили причастность внеклеточных сигнальных молекул в бактериальном ответе на антибактериальный стресс (Fux et al., 2005).


            1. 2 «Чувство кворума» (Quorum Sensing)


      Благодаря чувству кворума бактерии оценивают собственную численность по концентрации выделяемого всеми клетками сигнального вещества. Если плотность бактериальных клеток достаточно высокая, то бактерии предпринимают те или иные коллективные действия.

7

Феномен социального поведения бактерий, или "чувство кворума"

(Quorum sensing, QS), был впервые описан при изучении биолюминесценции у морской бактерии Vibrio fisheri. Было доказано, что свечение бактерий, обусловленное продуктами генов биолюминесценции, осуществляется при достижении бактериями определенной плотности популяции и контролируется сигнальными молекулами, продуцируемыми самими бактериями и работающими по принципу аутоиндукторов (АИ). После того, как молекулы АИ были выделены, удалось исследовать их структуру. Первый известный АИ оказался З-охо-Сб-HSL ацил-гомосеринлактоном (AHL), который свободно диффундирует из бактериальных клеток в окружающую среду и обратно (Рис. 2). Сигнальные молекулы производятся AHL синтетазой, кодируемой геном luxl, который был впервые идентифицирован у Vibrio fischeri (Engebrecht и Silverman, 1984). При низких плотностях популяции, luxl является конститутивно экспрессируемым на низком, базальном уровне, благодаря чему AHL накапливаются в среде.

8

      Рисунок 2 - Химическая структура некоторых N-ацил-гомосеринлактонов.

      Белок LuxR является активатором, способным связываться с молекулами АИ и в таком виде активировать транскрипцию оперонов и генов, контролируемых QS системой. LuxR семейство белков регуляторов рецептора/ответа реагирует на AHL. На некоторой пороговой концентрации AHL, сигнальная молекула формирует комплекс с белком-рецептором, который становится активированным. Активированный комплекс сигнала и рецептора в свою очередь формирует димеры или мультимеры с другими активированными LuxR-AHL комплексами. Эти димеры или мультимеры функционирую как регуляторы транскрипции, контролирующие экспрессию QS -регулируемые гены-мишени. QS парадигма заявляет, что транскрипция QS-генов активируется при некоторой плотности популяции (которая является пропорциональной AHL концентрации) известной как «размер кворума» - число бактерий, требуемых активировать QS систему (Eberl, 1999; Fuqua et al., 1994; Salmond et al., 1995; Parsek et al., 1999).
      Теперь известно, что по типу QS, помимо биолюминесценции, регулируется широкий спектр физиологических процессов, включая синтез детерминант вирулентности у патогенных бактерий, перенос конъюгативных плазмид, синтез антибиотиков, образование биопленок и даже процесс репликации у Е.соП. У грамположительных бактерий в качестве молекул, регулирующих социальное поведение, чаще всего выступают пептиды или модифицированные пептиды.
      Так как бактерии используют диффундирующие сигнальные молекулы, чтобы контролировать фенотипы в окружающей среде, и эти ответы часто вовлекают эукариотического хозяина, то вполне закономерно, что эукариотические организмы могли бы выработать

9

механизмы, использующие бактериальные сигналы для собственной выгоды. Есть доказательство таких взаимодействий между световыми органами кальмара и рыбы, чтобы привлечь и управлять биолюминисцентным симбионтом (Ruby, et al., 1999) и есть доказательство, что растения могут производить внеклеточные факторы, которые вызывают AHL фенотипы у Agrobacterium (Piper et al., 1993; Zhang et al., 1993).
      В то время как взаимодействие прокариот-эукариотов в некоторых случаях выгодно для обоих, явно есть примеры, где прокариоты вредны для эукариотического хозяина. У нескольких патогенных бактерий, использующих системы Luxl/LuxR во время колонизации растений или животных, установлена связь между явлением QS и вирулентностью. Показано участие регуляторных систем QS в контроле экспрессии генов вирулентности у холерного вибриона, у бактерий Burkholderia, у энтеропатогенных и энтерогеморрагических E.coli, у сальмонелл.
      Наиболее хорошо системы QS изучены у Pseudomonas aeruginosa и Staphilococcus aureus. Этот генетический механизм позволяет патогенным бактериям очень рационально реализовать свой болезнетворный потенциал. Бактерии атакуют эукариотическую клетку хозяина, синтезируя факторы патогенности, только после достижения ими определенной плотности, при которой синтезирующееся количество факторов патогенности гарантирует успешное развитие инфекционного процесса. Данный момент определяется системой QS. Вследствие того, что аутоиндукторы играют центральную роль в экспрессии черт множественной вирулентности у P. aeruginosa, QS система представляет потенциальную мишень для антибактериальных препаратов.

10

            1.2.1 QS-Системы, использующие AI-2


      Аутоиндуктор AI-2 впервые обнаружили в клетках Vibrio harveyi . Это соединение с необычной структурой накапливается во второй половине экспоненциальной фазы роста, но содержание его резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу.
      Синтаза AI-2 - белок LuxS - кодируется геном luxS ; гены luxS высоко гомологичны у разных бактерий. Виды бактерий, которые содержат luxS гены, включают (но не ограничиваются) Е. coli, Salmonella typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus , Clostridium perfringens , Klebsiella pneumoniae и др. Фактически, ген luxS присутствует в половине всех секвенированных бактериальных геномов.
      AI-2 синтезируется в три стадии из S-аденозилметионина; субстратом для LuxS-синтазы является S-аденозилгомоцистеин, который превращается в аденин, гомоцистеин и 4,5-дигидрокси-2,3-пентандион (DPD). Из DPD, весьма реактивного соединения, легко перестраивающегося и вступающего в дополнительные реакции, могут образоваться сигнальные молекулы, которые различные виды бактерий распознают как AI-2. Установлена структура еще одной сигнальной молекулы AI-2 у Salmonella typhimurium ; это вещество фурановой природы отличается от AI-2 V. harveyi , в том числе, отсутствием атома бора. Показано, что эти два AI-2 и их предшественники, образуемые из DPD , в природных условиях могут находиться в равновесии и легко взаимопревращаться. Предполагают, что появление бора в молекуле AI-2 V. harveyi может быть связано с высокой концентрацией этого элемента в морской воде, где обитает эта бактерия. В то же время концентрация бора в условиях обитания S. typhimurium значительно

11