Краткое руководство по микроскопической диагностике инфекций, передаваемых половым путем


A. M. Савичева, Е. В. Соколовский, М. Домейка






КРАТКОЕ РУКОВОДСТВО ПО МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ
ПОЛОВЫМ ПУТЕМ














Санкт- Петербург Фолиант 2004

УДК 616.97
ББК 55.81





   Савичева А. М., Соколовский Е. В., Домейка М.
   Краткое руководство по микроскопической диагностике инфекций, передаваемых половым путем. — СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2004. — 128 с.: ил.


   ISBN 5-93929-088-4


           Руководство посвящено методам микроскопической диагностики широко распространенных инфекций, передаваемых половым путем, а также бактериального вагиноза и урогенитального кандидоза. Излагаются общие принципы работы с разными типами микроскопов, способы взятия клинического материала для исследования, методы окрашивания, интерпретация результатов микроскопического исследования. Подробно описана методология проведения исследований, формулировки заключений, что позволяет правильно организовать процесс диагностики ИППП в медицинских учреждениях. Представлен большой авторский иллюстративный материал, а также перечень необходимого оборудования и реагентов для проведения микроскопических исследований.
           Книга предназначена для врачей-дерматовенерологов, акушеров-гинекологов, урологов, инфекционистов, микробиологов, а также специалистов по лабораторной диагностике. Может быть использована в качестве учебного пособия для слушателей последипломного образования.


Савичева Алевтина Михайловна руководитель лаборатории микробиологии Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, доктор медицинских наук, профессор


Соколовский Евгений Владиславович
заведующий кафедрой дерматовенерологии с клиникой Санкт-Петербургского государственного медицинского Университета им. акад. И. П. Павлова, доктор медицинских наук, профессор

Домейка Мариус
руководитель секции ИППП Шведского института по контролю за инфекционными заболеваниями; директор Центра, сотрудничающего с ВОЗ, Университета Уппсала, доктор наук, профессор








ISBN 5-93929-088-4

                                     © Коллектив авторов, 2004
                © ООО «Издательство Фолиант», 2004

            СОДЕРЖАНИЕ



Введение ........................................................ 5

Взятие материала для исследования ..............................  5
   Взятие материала для микроскопии нативных препаратов ......... 8
   Взятие материала для микроскопии окрашенных препаратов.......  8
      Взятие клинического материала у мужчин .................... 8
      Взятие клинического материала у женщин..................... 9
   Взятие материала для прямой иммунофлюоресценции................ 10
   Взятие материала для исследования из прямой кишки ........... 11
   Взятие материала для исследования из носоглотки .............. И
   Взятие материала для исследования с эрозий/язв кожи и слизистых оболочек......................................... 11
   Взятие материала для исследования из лимфатических узлов..... 12
   Транспортировка материала ................................... 13
Методы окрашивания ............................................. 13
   Простая окраска ............................................. 14
      Окраска метиленовым синим................................. 14
      Окраска метиленовым синим по Леффлеру..................... 15
   Сложные дифференциальные методы окраски ..................... 15
      Окраска по методу Грама................................... 15
      Окраска по Цилю—Нильсену.................................. 17
      Окраска по Романовскому—Гимзе ............................ 17
      Окраска по способу Нейссера .............................. 18
      Окраска по методу Папаниколау............................. 19
   Прямая иммунофлюоресценция................................... 20
      Выявление Chlamydia trachomatis методом прямой иммунофлюоресценции ...................................... 20
      Выявление ВПГ-1 и ВПГ-2 методом прямой иммунофлюоресценции ...................................... 21
      Выявление Treponema pallidum методом прямой иммунофлюоресценции ...................................... 22
   Выявление Treponema pallidum методом темнопольной микроскопии . 23
Устройство микроскопа и принципы работы......................... 25
   Устройство светового микроскопа проходящего света ........... 25
   Уход за микроскопом ......................................... 27
Методы микроскопии в проходящем свете .......................... 27
   Метод светлого поля.......................................... 27
      Возможные проблемы и их решение .......................... 28
      Смена объективов при проведении микроскопии .............. 29
      Порядок проведения микроскопического исследования ........ 30
   Метод темного поля........................................... 31
      Порядок работы с темнопольным иммерсионным конденсором .     31
      Возможные проблемы темнопольной микроскопии и их решение................................................ 32
   Метод фазового контраста .................................... 32
      Возможные проблемы микроскопии в фазовом контрасте и их решение ............................................... 33
   Метод люминесцентной   микроскопии .......................... 33
      Возможные проблемы люминесцентной микроскопии и их решение ............................................... 34

3

Оценка данных микроскопического исследования ..................... 35
   Морфология обычного микроскопического объекта ................. 35
   Микроскопия нативных препаратов ............................... 46
       Микроскопия нативных препаратов при малом увеличении х 100   46
       Микроскопия нативных препаратов при большом увеличении х 400 50
   Микроскопия окрашенных препаратов ............................. 58
       Оценка результата при исследовании мазка, окрашенного по Граму................................................... 66
   Оценка результата ПИФ при диагностике  ИППП.................... 72
       Хламидийная инфекция....................................... 72
       Герпетическая инфекция ...................................  76
       Сифилитическая инфекция .................................   77
Микрофлора урогенитального тракта в норме   ...................... 79
   Структура эпителия генитального тракта   ...................... 79
   Нормальная микрофлора генитального тракта ..................... 79
Микрофлора урогенитального тракта при нарушении нормального микробиоценоза ................................................... 84
   Бактериальный вагиноз ......................................... 84
   Кандидоз ...................................................... 87
Микроскопические исследования при ИППП      ...................... 89
   Гонорея ....................................................... 89
   Хламидийная инфекция........................................... 90
   Сифилис ....................................................... 98
   Трихомониаз ...................................................102
   Шанкроид (мягкий шанкр, ulcus molle) ...........................104
   Паховая гранулема (донованоз, венерическая гранулема) ..........105
   Неспецифический (бактериальный) уретрит/цервицит ..............107
   Неспецифический (бактериальный) вульвовагинит ..................108
   Генитальный герпес .............................................109
   Папилломавирусная инфекция ......................................ПО
   Чесотка ........................................................113
   ВИЧ/СПИД........................................................113
Заключение......................................................... 114
Приложения ........................................................115
   Диагностические тесты для различных ИППП........................117
   Реагенты, красители............................................122
   Лабораторное оборудование ...................................... 125
   Безопасность персонала ......................................... 126
Литература ....................................................  .  127

            ВВЕДЕНИЕ



  Микроскопические методы исследования, позволяющие достаточно быстро и дешево поставить предварительный диагноз уже при первом визите к врачу, являются важной составной частью диагностики ИППП (инфекций, передаваемых половым путем). Своевременно поставленный диагноз и вовремя назначенная терапия предупреждают дальнейшее распространение инфекции. В ряде случаев микроскопия может быть использована в качестве скринингового метода.
  Качество микроскопической диагностики зависит от используемого микроскопа, тщательного соблюдения правил взятия, транспортировки и окрашивания материала, уровня подготовки и опыта исследователя.
  Микроскопические методы исследования позволяют увидеть клетки эпителия генитального тракта, лейкоциты, оценить степень воспалительной реакции, а также определить морфологию микроорганизмов, населяющих слизистые оболочки половых органов, и оценить их количество в мазке, помещенном на предметном стекле.


            ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ


  Приготовление мазка — это нанесение отделяемого, полученного с поверхностей слизистых оболочек или кожи, на предметное стекло. Микроскопическое исследование включает не только идентификацию эпителия, микроорганизмов и других морфологических частиц, но также оценку их количества и соотношения. Качество мазка зависит от физиологического состояния пациента на момент взятия мазка. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при следующих условиях:


5

   —    мазки взяты при наличии клинических признаков заболевания;
   —    пациент не использовал местного лечения минимум в течение последних 48—72 ч;
   —    у женщин при исследовании материалов из урогенитального тракта взятие образцов желательно проводить приблизительно в середине менструального цикла (если заболевание не имеет явных проявлений) или в дни, когда нет кровянистых выделений (при обострении процесса);
   —    у мужчин при исследовании материалов взятие образцов из уретры необходимо проводить при условии задержки мочеиспускания не менее 3—4 ч;
   — пациент не принимал душ в течение 24 ч.

   Если нет возможности придерживаться упомянутых условий, то следует помнить, что это может повлиять на качество мазков и исказить интерпретацию результатов микроскопии.
   Всегда необходимо учитывать, что проведение системной терапии, особенно антибактериальными препаратами, может значительно повлиять на результат микроскопического исследования и снизить его диагностическую ценность.
   Перед взятием образца важно понимать, какой материал должен быть взят и что предполагается обнаружить. Обычно во время обследования пациента необходимо брать несколько клинических образцов (не только для микроскопии, но также и для других лабораторных исследований). Важно помнить, что:
   — Материал из уретры для микроскопического исследования берется раньше всех других уретральных образцов или сразу же после взятия выделений или проб для культурального исследования на гонококки.
   — Материал для приготовления нативного мазка из влагалища берется раньше всех других вагинальных проб. Участок влагалища, с которого нужно взять пробу, зависит от клинической ситуации. Если имеются обильные выделения и подозревается трихо-монадная или кандидозная инфекция, образец берется из заднего свода, где концентрация предполагаемого инфекционного агента наибольшая. Если количество выделений обычное, образец следует брать с боковой стенки влагалища. Этот клинический материал даст наиболее надежную информацию о состоянии влагалища в данный момент.
   — Образец из шейки матки для микроскопического исследования берется раньше всех других цервикальных образцов или сразу же после взятия мазка для культурального исследования на гонококки.

6

Рис. 1. Инструменты для взятия клинического материала

   — Предметные стекла должны быть сухими, чистыми, не поцарапанными (оптимально применять новые стекла для каждого нового пациента).
   — Мазок наносится тонким слоем только на одну сторону предметного стекла.
   — Если количество материала небольшое или Вы хотите поместить на одно стекло несколько образцов материала из разных локализаций у одного пациента, материал должен наноситься ближе к центру стекла в заранее обозначенных областях.
   — Физиологический раствор должен быть теплым (оптимально 37° С). Эта температура позволяет легче распознать подвижные трихомонады.
   Клинический материал можно получать с помощью пластиковой бактериологической петли, ложечки Фолькмана или ватно-го/дакронового тампона (рис. 1). Предпочтение во всех случаях следует отдавать дакроновым тампонам. Для удобства можно использовать одно стекло как для уретрального, так и для цервикального мазка. Для приготовления влажного мазка из вагины берется другое стекло. При использовании бактериологической петли материал наносится на предметное стекло штриховыми движениями тонким слоем. Ватный/дакроновый тампон прокатывается по стеклу для перенесения материала. Материал из ло

7

жечки Фолькмана наносится на предметное стекло и слегка размазывается по стеклу ее тыльной стороной.
   Все мазки, приготовленные для направления в лабораторию, должны быть высушены на воздухе и, при необходимости, зафиксированы.


ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА
ДЛЯ МИКРОСКОПИИ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ

   Для микроскопии влажных нативных препаратов используется отделяемое влагалища у женщин. У мужчин прямая микроскопия влажных мазков проводится при наличии обильных выделений из уретры с исследованием свободного отделяемого или смыва.
   Вагинальный образец для приготовления влажного (нативного) мазка берется в зеркалах бактериологической петлей объемом 10 мкл с определенного анатомического участка (задний или боковой свод). Материал из уретры берется бактериологической петлей объемом 1 мкл. Из препуциального мешка материал берется ватным/дакроновым тампоном.
   На предметное стекло помещается капля теплого физиологического раствора (оптимально 37° С). Вагинальные или уретральные выделения перемешиваются с каплей физиологического раствора, накрываются покровным стеклом и немедленно просматриваются с использованием светового микроскопа. Если врач не владеет методом прямой микроскопии, выделения помещаются в пробирку с теплым физиологическим раствором и немедленно направляются в лабораторию для микроскопического исследования.



ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ МИКРОСКОПИИ ОКРАШЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Взятие клинического материала у мужчин

   Образец из уретры для окрашивания по Граму или метиленовым синим берется с помощью бактериологической петли объемом I мкл. У мужчин при наличии выделений из уретры поверхность головки и область наружного отверстия уретры должны быть очищены с помощью марлевого тампона и крайняя плоть отведена назад для предупреждения контаминации. При отсутствии свободных выделений необходимо попросить пациента слег

8

ка помассировать уретру скользящими движениями от основания пениса к его головке. В этом случае могут быть использованы ложечка Фолькмана или ватный/дакроновый тампон для взятия материала. После введения пластиковой петли в уретру на 1—2 см необходимо плоскость «глазка» петли двигать к отверстию, слегка нажимая на стенки уретры. Не рекомендуется вращать петлю во время процедуры взятия образца. Для пациента это болезненно. После получения клинического материала петля накладывается на поверхность стекла и передвигается по нему несколько раз с легким нажатием. Петля должна оставить на стекле тонкую полоску клинического материала.
   Образец из препуциального мешка берется ватным/дакроно-вым тампоном.

Взятие клинического материала у женщин

   Образец из уретры для окрашивания по Граму или метиленовым синим берется с помощью бактериологической петли объемом 1 мкл. При наличии большого количества выделений наружное отверстие должно быть очищено с помощью марлевого тампона. При отсутствии свободных выделений может быть проведен легкий массаж уретры, выполняемый врачом. После введения пластиковой петли в уретру на 1—2 см необходимо плоскость «глазка» петли двигать к отверстию, слегка нажимая на заднюю и боковые стенки уретры. Не рекомендуется вращать петлю во время процедуры взятия образца. Для пациентки это болезненно. После получения клинического материала петля накладывается на поверхность стекла и передвигается по нему несколько раз с легким нажатием. Петля должна оставить на стекле тонкую полоску клинического материала.
   Образец из цервикального канала для приготовления окрашенных препаратов берется в зеркалах ватным/дакроновым тампоном, специальной щеточкой или ложечкой Фолькмана. Необходимо тщательно очистить наружное отверстие цервикального канала при помощи большого марлевого тампона от вагинальных выделений для предотвращения возможной контаминации. После введения тампона в шеечный канал на 1—2 см его вращают несколько раз. Клинический материал должен быть перенесен с тампона на стекло как можно более тонким слоем.
   Для микроскопического исследования окрашенных вагинальных мазков материал берется в зеркалах с заднего или боковых сводов бактериологической петлей 10 мкл или ложечкой Фолькмана и тонким слоем распределяется на предметном стекле.


9

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРЯМОЙ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

   Следует предостеречь от использования иммунолюминесцент-ных методов при выявлении микоплазм, уреаплазм, трихомонад, дрожжеподобных грибов, так как их диагностическая значимость в настоящее время еще не установлена.
   Иммунолюминесцентные методы предусматривают обнаружение антигенов возбудителей. При люминесцентной микроскопии выявляются специфические включения в виде зеленой или желто-зеленой флюоресценции на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток. Включения могут иметь зернистую, гомогенную или смешанную структуру. С помощью иммунолюминесцентных методов можно обнаружить не только корпускулярные, но и растворимые антигены. Эти методы используются для выявления хламидий, вируса простого герпеса, аденовирусов, трепонем и некоторых других возбудителей.
   Для взятия материала используются специальные дакроновые тампоны или специальные щеточки.
   Перед взятием материала подготовка пациентов проводится в соответствии с рекомендациями, описанными выше.
   Уретра', специальный тампон вводится на 1,5—2 см, вращается 15 с и выводится.
   Цервикальный канал', специальным тампоном убирается слизь, вторым тампоном берется материал, вводя тампон на 2—3 см в цервикальный канал и вращая 15 с.
   Конъюнктива', специальным тампоном необходимо провести по нижнему веку.
   Носоглотка', специальным тампоном провести по задней стенке глотки.
   Эрозии/язвы кожи и слизистых оболочек', специальным тампоном берется содержимое пузырьков и/или отделяемое эрозивно-язвенной поверхности проявлений на коже и слизистых оболочках. При бессимптомных формах берется соскоб эпителия уретры и/или цервикального канала. При герпетической инфекции взятие материала необходимо осуществлять в период выделения вируса: при первичном инфицировании оно продолжается около 12 дней, при рецидивах — около 5 дней.
   Тампон помещается на специальное предметное стекло с лункой в середине стекла. Вращательным движением тампон «прокатывается» по стеклу через лунку.
   Внимание! При нанесении материала тампоны должны прокатываться по стеклу.
   Препарат высушивается на воздухе при комнатной температуре. Материал должен быть доставлен в лабораторию в тот же день. В случае необходимости фиксированные в течение 10 мин холодным ацетоном препараты можно хранить при 4—6°С в течение 3 дней, при —20° С — в течение 1 месяца.

10

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗ ПРЯМОЙ КИШКИ

   Материал для исследования берется у пациентов, имевших анальный секс.
   Идеальным является взятие материала при проведении про-ктоскопии, что позволяет одновременно получить представление о состоянии ректальной слизистой оболочки. Взятие материала проводится ватным/дакроновым тампоном путем проведения им по стенке прямой кишки. Наиболее информативным оказывается это исследование при наличии гнойного отделяемого. Материал может быть использован для исследования на гонорею (микроскопическое исследование при окраске по Граму и метиленовым синим и культуральное исследование), а также на хламидии методом прямой иммунофлюоресценции.



ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗ НОСОГЛОТКИ

   Материал для исследования берется у пациентов, имевших оральный секс.
   Взятие материала проводится ватным/дакроновым тампоном путем проведения им по задней стенке глотки. Материал может быть использован для исследования на гонорею (микроскопическое исследование при окраске по Граму и метиленовым синим и культуральное исследование), а также на хламидии методом прямой иммунофлюоресценции.



ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ С ЭРОЗИЙ/ЯЗВ КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК

  Отделяемое с поверхностей эрозий и язв генитальной или эк-страгенитальной локализации должно быть исследовано методом темнопольной микроскопии при подозрении на сифилис. До взятия материала поверхность дефекта должна быть очищена тампоном, смоченным физиологическим раствором. Дефект слегка массируется путем сдавливания пальцами под основание до появления на его поверхности серозного отделяемого. Капля отделяемого переносится бактериологической петлей на предметное стекло, где смешивается с равным количеством физиологического раствора и накрывается покровным стеклом. Темнопольная микроскопия должна быть проведена в течение 10 мин, так как подвижность трепонем значительно уменьшается.


11

  При подозрении на шанкроид вначале удаляют некротическое отделяемое с поверхности язвы и затем берут материал ват-ным/дакроновым тампоном из-под нависающего края язвы. Применяется культуральное исследование с целью выделения Haemophilus ducreyi. Также может быть использован микроскопический метод выявления грамотринательных микроорганизмов.
  При подозрении на донованоз (паховая лимфогранулема) материал берется с основания язвенного дефекта или с его периферии после тщательной очистки тампоном, смоченным физиологическим раствором. Материал (кусочек ткани) берется ложечкой Фолькмана или кюреткой и используется для микроскопического исследования при окраске по Романовскому—Гимзе. Кроме того, используется культуральный метод диагностики с выделением Calymmatobacterium granulomatis.
  Для диагностики чесотки используется микроскопия соскобов эпидермиса, полученных из мест наибольшей локализации высыпаний.


ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ

   Для получения тканевой жидкости проводят пункцию лимфатического узла. Пунктируют лимфатический узел, наиболее близко расположенный к месту локализации первичного аффекта. Процедуру пунктирования проводят у пациента в лежачем положении, с соблюдением всех правил асептики. Если в области пунктирования имеются волосы, их тщательно сбривают. Кожу над лимфоузлом обрабатывают этиловым спиртом, место прокола смазывают 3% спиртовым раствором йода. Шприц для пункции должен быть сухим, иметь плотно пригнанный поршень и иглу с затупленным концом. Пунктируемый лимфатический узел фиксируют I и II пальцами левой руки; правой рукой делают послойный прокол кожи и лимфатического узла по его длинной оси, продвигают иглу до конца узла, одновременно слегка массируя его. Затем медленно выдвигают иглу назад, одновременно отсасывая шприцем содержимое лимфатического узла. При так называемой «пункции с обогащением» в корковый слой лимфоузла вводят предварительно 0,1—0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, узел массируют и затем отсасывают содержимое. В обоих случаях материал для исследования оказывается, как правило, в просвете иглы.


12