Влияние тяжелых металлов на большого прудовика

УДК 594.381.5:591.1[546.6+546.48]

Дромашко, С. Е. Влияние тяжёлых металлов на большого 

прудовика Lymnaea stagnalis L. / С. Е. Дромашко, С. Н. Шевцова, 
А. С. Бабенко ; под общ. ред. С. Е. Дромашко ; Нац. акад. наук 
Беларуси, Ин-т генетики и цитологии ; Белорус. общество генетиков и селекционеров. – Минск : Беларуская навука, 2018. – 
172, [2] с. – ISBN 978-985-08-2327-4.

Одними из приоритетных поллютантов поверхностных вод Республики 

Беларусь являются соли тяжёлых металлов, вызывающие токсический эффект 
у водных и околоводных организмов на молекулярно-клеточном уровне. Брюхоногий моллюск Lymnaea stagnalis (большой прудовик) рекомендован Министерством здравоохранения Республики Беларусь для оценки эмбриотоксичности и генотоксичности при биотестировании металлосодержащих отходов 
и потенциально опасных химических веществ. В монографии описаны результаты исследований воздействия солей свинца, никеля, меди, кобальта, 
цинка, кадмия на различные стадии жизненного цикла L. stagnalis (эмбриональное развитие, ювенильные и половозрелые особи). У половозрелых особей 
большого прудовика изучены репродуктивные и цитогенетические показатели, а также экспрессия генов металлотионеинов – многофункциональных 
стрессорных белков.

Рассчитана на научных работников, преподавателей вузов, аспирантов, 

магистрантов, студентов, а также на всех, кто интересуется оценкой качества 
водных экосистем с помощью биологических объектов.

Таб. 27. Ил. 41. Библиогр.: 265 назв.

Р е ц е н з е н т ы:

доктор биологических наук, профессор  С. Б. Мельнов,

доктор биологических наук, доцент  В. М. Байчоров

ISBN 978-985-08-2327-4
© Дромашко С. Е., Шевцова С. Н., 
    Бабенко А. С., 2018
© Оформление. РУП «Издательский дом
    «Беларуская навука», 2018

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение ...........................................................................................................  
6

Принятые сокращения .................................................................................  
11

Глава 1. Антропогенное воздействие на гидроэкосистемы и перспективы применения моллюсков в биомониторинге и биотестировании ....  
12

1.1. Загрязнение водной среды тяжёлыми металлами: общее состояние и тенденции .....................................................................................  
12

1.2. Формы нахождения и миграция тяжёлых металлов в экосистемах пресных водоёмов ............................................................................  
18

1.3. Роль моллюсков в пассивном и активном мониторинге водных 
экосистем ..................................................................................................  
23

1.4. Перспективы применения L. stagnalis и других брюхоногих 
моллюсков в биотестировании водной среды .....................................  
29

1.5. Методы нормирования тяжёлых металлов в водной среде 
и проблема оценки качества пресных вод ............................................  
36

1.6. Использование экспрессии генов металлотионеинов для оценки 
качества водной среды ............................................................................  
39

Глава 2. Материалы и методы, используемые при изучении эффектов 
солей тяжёлых металлов у Lymnaea stagnalis L. .....................................  
42

2.1. Объект исследования ........................................................................  
42

2.2. Приготовление растворов солей тяжёлых металлов и условия 
проведения экспериментов .....................................................................  
43

2.3. Изучение эмбрионального развития L. stagnalis в условиях влияния солей тяжёлых металлов ...............................................................  
46

2.4. Оценка роста особей L. stagnalis на ювенильной стадии жизненного цикла в условиях влияния солей тяжёлых металлов ...........  
48

2.5. Оценка репродуктивных показателей и организации зародышевых капсул у L. stagnalis в условиях влияния солей тяжёлых 
металлов ....................................................................................................  
49

2.6. Анализ цитологических препаратов гемоцитов L. stagnalis .......  
50

2.7. Статистическая обработка и анализ данных .................................  
52

2.8. Исследование экспрессии металлотионеинов ..............................  
52

Глава 3. Влияние солей тяжёлых металлов на эмбриональное развитие Lymnaea stagnalis L. ................................................................................  
54

3.1. Эффекты ацетата свинца ..................................................................  
54

3.2. Эффекты нитрата никеля .................................................................  
58

3.3. Эффекты сульфата меди ..................................................................  
63

3.4. Эффекты сульфата кобальта ............................................................  
68

3.5. Эффекты ацетата цинка ...................................................................  
72

3.6. Эффекты ацетата кадмия .................................................................  
76

Глава 4. Влияние солей тяжёлых металлов на рост ювенильных 
особей Lymnaea stagnalis L. ..........................................................................  
83

4.1. Эффекты солей свинца, никеля, меди, кобальта, цинка, кадмия ....  
83

4.2. Сравнение эффектов солей тяжёлых металлов на рост молоди 
лёгочных моллюсков ...............................................................................  
87

Глава 5. Влияние солей тяжёлых металлов на репродуктивные показатели и организацию зародышевых капсул у Lymnaea stagnalis L.....  
92

5.1. Эффекты ацетата свинца ..................................................................  
92

5.2. Эффекты нитрата никеля .................................................................  
96

5.3. Эффекты сульфата меди ..................................................................  
98

5.4. Эффекты сульфата кобальта ............................................................  
102

5.5. Эффекты ацетата цинка ...................................................................  
103

5.6. Эффекты ацетата кадмия .................................................................  
106

Глава 6. Влияние солей тяжёлых металлов на цитогенетические показатели гемоцитов у половозрелых особей Lymnaea stagnalis L. ......  
114

6.1. Эффекты ацетата свинца ..................................................................  
114

6.2. Эффекты нитрата никеля.................................................................  
116

6.3. Эффекты сульфата меди ..................................................................  
117

6.4. Эффекты ацетата цинка ...................................................................  
119

6.5. Эффекты ацетата кадмия .................................................................  
120

Глава 7. Разработка на основе полимеразной цепной реакции тест- 
системы для оценки влияния тяжёлых металлов на экспрессию 
металлотионеина у половозрелых особей Lymnaea stagnalis L. ..........  
123

7.1. Конструирование нескольких наборов специфических олигонуклеотидных праймеров для амплификации кДНК фрагмента гена 
металлотионеина L. stagnalis .................................................................  
123

7.2. Оптимизация условий классической полимеразной цепной 
реакции......................................................................................................  
128

7.3. Молекулярное клонирование кДНК фрагмента гена металлотионеина L. stagnalis с целью получения положительного контроля 
полимеразной цепной реакции ..............................................................  
131

7.4. Оптимизация условий амплификации фрагмента кДНК гена 
металлотионеина L. stagnalis методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ..........................................................  
136

7.5. Использование разработанных подходов на примере оценки 
эффектов ацетата свинца и ацетата кадмия .........................................  
140

Заключение .....................................................................................................  
147

Conclusions .......................................................................................................  
150

Литература и источники .............................................................................  
153

Кромсаем лёд,
меняем рек теченье,
твердим о том, что дел невпроворот…
Но мы еще придем
                               просить прощенья
у этих рек,
барханов
и болот,
у самого гигантского
                               восхода,
у самого мельчайшего
                               малька...
Пока об этом
думать неохота.
Сейчас нам не до этого
пока.
Аэродромы,
                    пирсы
                               и перроны,
леса без птиц
и земли без воды...
Всё меньше –
                      окружающей природы,
Всё больше –
                      окружающей среды.

  Р о б е р т   Р о ж д е с т в е н с к и й

ВВЕДЕНИЕ

По мере роста численности населения и развития промыш
ленности расширяется спектр и увеличивается число ксенобиотиков, загрязняющих биосферу. Известно, что в данном отношении 
водная среда отличается максимальной уязвимостью, поскольку 
большинство загрязнителей успешно накапливаются компонентами гидроэкосистем, но элиминируются из них чрезвычайно 
медленно [1]. В пресные водоёмы постоянно поступает огромное количество промышленных, бытовых и сельскохозяйственных отходов при сбросе недостаточно очищенных сточных вод, 
путём атмосферного переноса, в составе поверхностного стока.

Одними из приоритетных поллютантов поверхностных вод 

Республики Беларусь, как и многих других стран мира, являются 

соли тяжёлых металлов (ТМ) [2]. При поступлении в гидроэкосистемы значительных количеств металлосодержащих отходов, 
ТМ оказывают токсический эффект на водные и околоводные 
организмы на молекулярно-клеточном уровне [3].

В настоящее время на территории стран СНГ проводятся изу
чение и оценка воздействия ТМ и других техногенных загрязнителей на состояние гидроэкосистем. Исследования в данном 
направлении имеют не только большое фундаментальное значение, но и существенную практическую значимость, поэтому 
поиск и разработка наиболее чувствительных критериев оценки 
влияния ТМ на водные организмы не теряют актуальности.

В практике активного и пассивного биомониторинга приме
няются гидробионты, относящиеся к различным таксонам: от 
бактерий до рыб и млекопитающих. Различные представители 
типа Mollusca являются одними из наиболее широко используемых тест-систем в экологических и токсикологических исследованиях, а также играют существенную роль при проведении 
мониторинга водных объектов, испытывающих значительную 
техногенную нагрузку [4]. Брюхоногие моллюски отличаются 
рядом качеств, обусловливающих целесообразность их применения в экологическом мониторинге водных экосистем и в лабораторном биотестировании. Необходимость разработки протоколов биотестирования с применением пресноводных гастропод 
в лабораторных условиях обусловлена рядом причин.

Во-первых, сегодня брюхоногие моллюски практически отсут
ствуют среди объектов, используемых в системе оценки качества 
водной среды. Согласно литературным данным, существенную 
часть рациона пресноводных брюхоногих моллюсков составляет 
детрит [5], а сами моллюски оказывают существенное влияние на 
многие виды макрофитов, поедая не только перифитон, но и высшие водные растения [6]. Составляя существенную долю кормовой базы рыб и птиц, данные беспозвоночные играют значительную роль в функционировании водных экосистем и поддержании 
их целостности. Поэтому изучение откликов пресноводных моллюсков на химическое загрязнение водной среды является актуальным для экологической оценки состояния гидроэкосистем.

Во-вторых, перспективность применения пресноводных мол
люсков в практике биотестирования оправдана методической 
простотой и экономичностью [7]. В силу того, что репродуктивная система брюхоногих моллюсков отличается высокой чувствительностью к воздействию гормонально-активных загрязнителей водной среды, очевидна целесообразность оценки лекарственных средств и различных поллютантов органической природы на 
показатели воспроизводства этих гидробионтов как в целях биотестирования, так и для разработки природоохранных мер [8]. 
Относительно недавно пресноводные моллюски Potamopyrgus 
antipodarum и Lymnaea stagnalis были рекомендованы Организацией экономического сотрудничества и развития для проведения длительных хронических экспериментов по оценке воздействия гормонально-активных ксенобиотиков [9]. Кроме того, 
пресноводный брюхоногий моллюск Lymnaea stagnalis был рекомендован к использованию в качестве объекта для оценки эмбриотоксических свойств оловоорганических соединений [10].

Большой прудовик (Lymnaea stagnalis Linnaeus, 1758) широ
ко распространён в средней полосе Европы [11]. Данный вид 
вторичноводных моллюсков населяет озёра, пруды, водохранилища, а также заросшие макрофитами речные затоки [12]. Особи
L. stagnalis часто перемещаются по поверхности донных осаждений и различных подводных субстратов, а физиологическая 
необходимость периодического заполнения лёгочной полости 
атмосферным воздухом обусловливает частое всплывание лёгочных моллюсков к поверхности воды. Таким образом, лимнеид 
относят к массовым представителям макрозообентоса, которые 
могут применяться при интегральной оценке качества водной 
среды в силу особенностей образа жизни.

Для данного вида пресноводных моллюсков характерен 

двухлетний жизненный цикл, что наряду с относительной простотой отлова особей из естественных мест обитания позволяет 
использовать их в практике пассивного мониторинга состояния 
водоёмов, испытывающих существенную антропогенную нагрузку. Кроме того, высокая плодовитость, простота и экономичность 
поддержания лабораторной культуры L. stagnalis обусловливает 

возможность применения этих беспозвоночных в практике лабораторного биотестирования. Целесообразность использования 
большого прудовика в биотестировании подтверждается также 
наличием инструкций, одобренных Министерством здравоохранения Республики Беларусь по применению у данного вида 
некоторых показателей эмбриотоксичности и генотоксичности 
в биотестировании металлосодержащих отходов и потенциально 
опасных химических веществ [13, 14].

В Беларуси экологические и токсикологические исследова
ния с применением L. stagnalis проводятся в лаборатории моделирования генетических процессов Института генетики и цитологии НАН Беларуси под руководством доктора биологических 
наук С. Е. Дромашко, в лаборатории профилактической и экологической токсикологии Республиканского унитарного предприятия «Научно-практический центр гигиены» по инициативе кандидата биологических наук А. М. Войтовича, а также на 
базе кафедры биологии человека и экологии Международного 
государственного экологического института имени А. Д. Сахарова Белорусского государственного университета под руководством доктора биологических наук А. П. Голубева. Значительный теоретический и практический задел, сформированный 
к настоящему времени в изучении биологии и экологии лёгочных моллюсков в целом и большого прудовика в частности, 
может служить основой для дальнейшего развития и совершенствования методик применения брюхоногих моллюсков в практике биотестирования.

Таким образом, проведение экологических, токсикологиче
ских и экотоксикологических исследований с использованием
большого прудовика (Lymnaea stagnalis) является актуальным. 
Анализ литературных источников свидетельствует о том, что 
анатомо-физиологическая организация [15], особенности размножения [16] и эмбрионального развития [17, 18] L. stagnalis
являются хорошо изученными, что обусловливает широкое применение моллюсков данного вида в качестве объекта экологических и токсикологических исследований. На сегодня изучен 
ряд физиологических аспектов влияния сульфата меди, хлорида 

цинка, нитрата свинца на большого прудовика в остром эксперименте [19, 20]. В литературе также имеются данные о негативном воздействии солей кадмия и кобальта, наночастиц серебра на зародышевое развитие L. stagnalis [21–23]. Вместе с тем 
в большинстве опубликованных работ, посвящённых оценке 
воздействия солей ТМ на большого прудовика, использованы 
относительно высокие концентрации металлов (на порядок и более 
превышающие предельно допустимые концентрации – ПДК), 
фактически не регистрируемые даже в водных объектах с максимальной техногенной нагрузкой.

В связи с вышеизложенным, исследования воздействия солей 

ТМ на различные стадии жизненного цикла L. stagnalis актуальны для совершенствования системы оценки состояния водных 
экосистем в условиях техногенной нагрузки, а также методов 
оценки качества водной среды в практике. Большой интерес также представляет исследование эффектов солей ТМ на экспрессию 
генов металлотионеинов (МТ) – многофункциональных стрессорных белков.

Главы 1–6 основаны на материалах кандидатской диссерта
ции С. Н. Шевцовой «Воздействие солей тяжёлых металлов на 
эмбриологические, репродуктивные и цитогенетические показатели брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis L.», выполненной под руководством доктора биологических наук, профессора С. Е. Дромашко и защищенной в 2016 г. в Государственном 
научно-производственном объединении «Научно-практический 
центр Национальной академии наук Беларуси по биоресурсам». 
В основу написания главы 7 легли результаты, полученные 
в ходе выполнения проекта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований Х12-104 «Оценка влияния 
химических загрязнителей на изменение уровня экспрессии металлотионеинов Lymnaea stagnalis in vivo с помощью ПЦР в режиме реального времени», а также после его завершения в 2014 г. 
Эти материалы тоже нашли отражение в главах 1 и 2. В выполнении проекта Х12-104 принимал участие кандидат химических 
наук А. С. Бабенко, который также является автором данной монографии. 

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АОЗК – аномалии организации зародышевых капсул
АП – гемоциты с признаками апоптоза
АПТ – апоптотические тельца
АР – аномалии развития
ВЗС – внутренняя защитная система
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
КАСО – капсулы с аномалиями структурной организации
КОКЭ – капсулы с отклонениями в количестве эмбрионов на капсулу
МТ – металлотионеин(ы)
МЯ – гемоциты с микроядром(ами)
ПДК – предельно допустимая(ые) концентрация(и)
ПЗК – пустая зародышевая капсула
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЭЗК – «полиэмбриональная» зародышевая капсула
ПЯГ – полиморфно-ядерные гемоциты
РНК – рибонуклеиновая кислота
ТМ – тяжёлые металлы
Pg (генеративный прирост) – отношение суммарного значения массы кла
док, полученных от моллюсков экспериментальной группы, к числу особей 
группы за период эксперимента

RE (репродуктивное усилие) – отношение показателя генеративного при
роста к показателю соматического прироста, т. е. к среднему значению разности между массой тела моллюсков по окончании опыта и перед его началом

SF (суммарная плодовитость) – отношение суммарного числа зародыше
вых капсул, произведенных моллюсками экспериментальной группы, к числу 
особей группы за период эксперимента

Глава 1

АНТРОПОГЕННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
НА ГИДРОЭКОСИСТЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЛЮСКОВ 
В БИОМОНИТОРИНГЕ И БИОТЕСТИРОВАНИИ

1.1. Загрязнение водной среды тяжёлыми металлами:
общее состояние и тенденции

В условиях роста антропогенного пресса проблема адекват
ной оценки степени загрязнённости поверхностных вод приоритетными техногенными поллютантами (т. е. веществами, представляющими особую опасность для экосистем) – тяжёлыми 
металлами (ТМ), заслуживает особого внимания по нескольким 
причинам. Во-первых, в связи с феноменально высокими темпами извлечения человечеством запасов ТМ из недр Земли по 
сравнению со скоростью их естественного поступления в биосферу. Во-вторых, ТМ обладают высокой степенью биологической 
активности, тем самым представляя существенную угрозу для 
нормального функционирования гидроэкосистем. Это связано 
со способностью данных консервативных поллютантов аккумулироваться в различных органах и тканях живых организмов 
[24] и мигрировать по трофическим сетям.

Под понятием «тяжёлые металлы» подразумевают химиче
ские элементы с удельной плотностью более 5 г/см3 [25], значительные объёмы которых в результате деятельности человека 
поступают в гидросферу и губительно воздействуют на водные 
организмы [26]. К ТМ относится ряд эссенциальных элементов, 
которые в очень малых концентрациях жизненно необходимы 
растительным и животным организмам: медь, цинк, кобальт, железо, марганец, хром и др. Дефицит этих элементов в организме 
вызывает различные нарушения обмена веществ и может стать 
причиной серьезных патологий. В то же время, вследствие поступления микроэлементов в организм в количествах, значительно превышающих физиологические потребности, на начальных 

этапах происходит напряжение компенсаторно-приспособительных реакций, а в итоге возникают разнообразные проявления 
отравляющего влияния этих элементов, которые в данном случае рассматриваются как токсиканты.

Однако к категории ТМ причислены и такие элементы, кото
рые не относятся к эссенциальным (кадмий, ртуть, свинец и др.) 
и проявляют токсическое действие на живые организмы в концентрациях значительно более низких, чем микроэлементы. Таким 
образом, в дальнейшем под понятием «тяжёлые металлы» мы 
будем подразумевать элементы, способные в высоких концентрациях оказывать токсический эффект на живые организмы.

Согласно оценкам специалистов, основными источниками 

загрязнения гидросферы ТМ являются объекты топливно-энергетического и горнорудного комплексов, а также предприятия 
машиностроения, химической промышленности и автотранспорт. Количества ежегодно поступающих в окружающую среду 
токсичных отходов производственных предприятий по добыче 
и переработке металлов исчисляются миллионами тонн [27]. 
Поэтому неудивительно, что помимо естественных биогеохимических провинций, характеризующихся значительно более высокими (по отношению к диапазону биологического оптимума) 
фоновыми уровнями содержания ТМ в почвенной и водной 
среде [28], вклад антропотехногенных провинций в повышение 
уровня содержания ТМ в водных объектах значительно более 
существенен.

Сточные воды цехов электрохимического нанесения покры
тий в десятках масштабных предприятий гальванического производства Беларуси (ОАО «Минский подшипниковый завод», 
РУП «Минский тракторный завод», ЗАО «Атлант» (г. Минск), 
«БелАЗ» (г. Жодино), РУП «Минский автомобильный завод», 
РУП «Гомсельмаш», РУП «Витязь» (г. Витебск) и др.) в высоких 
концентрациях содержат такие ТМ, как хром, цинк, никель, 
медь, кадмий [29]. Нередко на выходе из очистных сооружений 
стоки гальванических производств содержат ТМ в концентрациях, сопоставимых с ПДК, установленными для сточных вод 
предприятий по металлообработке [30]. Например, это происходит