Текстовые фрагменты публикации
Александра Александровна Мельниченко Александр Николаевич Орехов Игорь Александрович Собенин
Атерогенная модификация липопротеидов
Александра Александровна Мельниченко Александр Николаевич Орехов Игорь Александрович Собенин
Атерогенная модификация липопротеидов
Роль в атерогенезе
LAP LAMBERT Academic Publishing
Impressum / Выходные данные
Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek: Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet uber http://dnb.d-nb.de abrufbar.
Alle in diesem Buch genannten Marken und Produktnamen unterliegen warenzeichen-, marken- oder patentrechtlichem Schutz bzw. sind Warenzeichen oder eingetragene Warenzeichen der jeweiligen Inhaber. Die Wiedergabe von Marken, Produktnamen, Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen u.s.w. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von jedermann benutzt werden durften.
Библиографическая информация, изданная Немецкой Национальной Библиотекой. Немецкая Национальная Библиотека включает данную публикацию в Немецкий Книжный Каталог; с подробными библиографическими данными можно ознакомиться в Интернете по адресу http://dnb.d-nb.de.
Любые названия марок и брендов, упомянутые в этой книге, принадлежат торговой марке, бренду или запатентованы и являются брендами соответствующих правообладателей. Использование названий брендов, названий товаров, торговых марок, описаний товаров, общих имён, и т.д. даже без точного упоминания в этой работе не является основанием того, что данные названия можно считать незарегистрированными под каким-либо брендом и не защищены законом о брендах и их можно использовать всем без ограничений.
Coverbild / Изображение на обложке предоставлено: www.ingimage.com
Verlag / Издатель:
LAP LAMBERT Academic Publishing
ist ein Imprint der/ является торговой маркой
OmniScriptum GmbH & Co. KG
Heinrich-Bocking-Str. 6-8, 66121 Saarbrucken, Deutschland / Германия
Email / электронная почта: info@lap-publishing.com
Herstellung: siehe letzte Seite/
Haпечатано: см. последнюю страницу
ISBN: 978-3-659-24312-7
Zugl./Утверд.: Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской Академии медицинскихт наук - 2013
Copyright/АВТОРСКОЕ ПРАВО © 2013 OmniScriptum GmbH & Co. KG
Alle Rechte vorbehalten. / Все права защищены. Saarbrucken 201 3
Содержание ВВЕДЕНИЕ.................................................5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................8
1.1 Роль модифицированных ЛНП в развитии атеросклероза.11
1.2 Модифицированные липопротеиды низкой плотности, циркулирующие в крови человека.........................14
1.3 Атерогенность липопротеидов низкой плотности.......21
1.4 Усиление атерогенности модифицированных in vitro ЛНП в результате их ассоциации................................23
1.5 Взаимодействие липопротеидов низкой плотности с компонентами внеклеточного матрикса.....................32
1.6 Липопротеидсодержащие циркулирующие иммунные комплексы...............................................34
2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................38
2.1 Аутопсийный материал...............................3 8
2.2 Гистохимическое выявление липидов..................38
2.3 Исследование посредством трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ).......................................38
2.4 Электронно-микроскопический гистохимический анализ.39
2.5 Хроматографическое определение липидов на криостатном срезе 39
2.6 Первичная культура субэндотелиальных клеток аорты человека...............................................39
2.7 Культура моноцитов-макрофагов крови человека......42
2.8 Получение сыворотки крови.........................43
2.9 Оценка антиатерогенного эффекта в модели in vitro.44
2.10 Определение пролиферативной активности............44
2.11 Определение синтеза клеточного белка..............45
2.12 Определение синтеза коллагена.....................45
2.13 Изучение внутриклеточного метаболизма эфиров холестерина46
2.14 Изучение внутриклеточного синтеза липидов.........47
2.15 Выделение и фракционирование липопротеидов низкой плотности..............................................47
2.15.1 Доноры.......................................47
2.15.2 Получение плазмы и сыворотки крови...........47
2.15.3 Выделение суммарной фракции липопротеидов низкой плотности из плазмы крови...........................48
2.15.4 Определение концентрации белка в препаратах ЛНП .... 48
2.15.5 Получение фракций нативных и циркулирующих множественно модифицированных липопротеидов низкой плотности...........................................49
2.16 Получение модифицированных ЛНП....................50
2.16.1 Модификация ЛНП протеолитическими ферментами.... 50
2.16.2 Модификация ЛНП миелопероксидазой (МПО)......50
2.16.3 Модификация ЛНП липолитическими ферментами....51
2.16.4 Модификация ЛНП дегликозилирующими ферментами -нейраминидазой.......................................51
2.16.5 Модификация ЛНП низкомолекулярными альдегидами эндогенного происхождения...........................52
2.17 Анализ модифицированных ЛНП.......................52
2.17.1 Экстракция липидов из ЛНП....................52
2.17.2 Анализ липидов ЛНП при помощи тонкослойной хроматографии.......................................53
2.17.3 Электрофорез в полиакриламидном геле.........53
2.17.4 Электрофорез в агарозном геле................54
2.17.5 Определение тиобарбитуровая кислота (ТБК)-реактивных продуктов...........................................54
2.17.6 Определение содержания сиаловой кислоты в ЛНП.55
2.17.7 Изучение особенностей структуры модифицированных ЛНП методом твердофазного иммуноферментного анализа..56
2.18 Определение степени ассоциации ЛНП и размера ассоциатов58
2.18.1 Определение относительного размера ЛНП (метод
флуктуации светопропускания)..........................58
2.18.2 Определение размера ассоциатов ЛНП.............59
2.18.3 Основные характеристики использованных в работе полаксамеров..........................................59
2.19 Ультразвуковое сканирование сосудов................60
2.20 Статистическая обработка данных....................61
3РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................62
3.1 Морфологическая визуализация и анализ распределения липидов в атеросклеротических поражениях человека........62
2
3.2 Оптимизация клеточной модели для оценки атерогенности ЛНП 68
3.3 Ассоциация ЛНП - ключевой фактор их атерогенности..71
3.3.1 Самоассоциация ЛНП...............................71
3.3.2 Разработка метода определения степени ассоциации
(срав нение методов светопропускания и светорассеяния).73
3.3.3 Ассоциация с внеклеточным матриксом..............75
3.3.4 Образование циркулирующих иммунных комплексов... 81
3.4 Модуляция ассоциации..................................92
3.4.1 Влияние различных модификаций частицы нативных липопротеидов низкой плотности на их устойчивость к
ассоциации..............................................92
3.4.2 Изучение конформационных изменений апоВ белка цммЛНП и ферментативно модифицированных ЛНП..........106
3.4.3 Модуляция ассоциации полаксамерами..............127
3.5 Разработка методов диагностики факторов атерогенности ... 138
3.5.1 Разработка и модификация метода определения уровня цммЛНП в сыворотке...................................138
3.5.2 Сравнение диагностической значимости цммЛНП и
ЦИК-ЛНП..............................................148
3.5.3 Оценка диагностической и прогностической значимости ЦИК 155
3.5.4 Разработка аналитической тест-системы для оценки
атерогенных свойств сыворотки.....................160
4ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................161
4.1 Морфологическая визуализация и анализ распределения липидов в атеросклеротических поражениях человека...161
4.2 Ассоциация ЛНП - ключевой фактор их атерогенности.166
4.3 Влияние различных модификаций частицы нативных ЛНП на
устойчивость липопротеидов к ассоциации.............174
4.4 Изучение конформационных изменений апоВ белка цммЛНП и ферментативно модифицированных ЛНП..................182
4.5 Экзогенные ингибиторы ассоциации ЛНП............183
4.6 Диагностическое и прогностическое значение ЦИК..185
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................189
3
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................190
ПРИЛОЖЕНИЕ................................216
Лабораторный регламент на создание макета аналитической тест-системы для применения в медицине при экспрессной диагностике атерогенных дислипидемий при сердечно сосудистых патологиях ..216
4
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания -наиболее распространенная причина инвалидизации и смертности в России и других индустриально развитых странах (Windecker S, 2013; Quarles, 2013). Большинство сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов человека (Pranavchand R, 2013). Одним из первых проявлений атеросклероза на клеточном уровне принято считать накопление липидов, в частности эфиров холестерина, в интиме артерий (Аничков, 1947; Cianciola NL, 2011). Источником липидов, накапливающихся в интиме сосудов, являются циркулирующие в крови липопротеиды низкой плотности (ЛНП) (Vukovic I, 2006; Alaupovic, 1971; Cookson, 1971). При этом нативные ЛНП, не накапливаются в культивируемых клетках в значимых количествах, то есть они - не атерогенны (Badimon L, 2009). С другой стороны, многими исследователями (Soran H, 2011; Orso E, 2011) было продемонстрировано, что ЛНП, модифицированные различным образом in vitro (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, вортексированные, гликозилированные и т.д.), эффективно захватываются субэндотелиальными и другими клетками, то есть являются атерогенными.
Оставалось не ясным, почему модифицированные такими разными способами ЛНП в конечном итоге обладают одним и тем же свойством - повышенным атерогенным потенциалом. В нашей лаборатории Тертов с соавт. (Orekhov AN, 1989; Sobenin IA, 1996; Tertov VV, 1998) изучали накопление липидов макрофагами после их инкубации с нативными, гликозилированными или окисленными ЛНП, а также с липопротеидами, модифицированными малоновым диальдегидом или нейраминидазой. Было показано, что модифицированные любым способом ЛНП образуют ассоциаты, и эти
5
ассоциаты проявляют атерогенные свойства. Авторы предположили, что все ЛНП, модифицированные разными способами in vitro, объединяет одно и то же свойство - пониженная устойчивость к ассоциации. Была выдвинута гипотеза: без модификации ЛНП невозможна их ассоциация (ассоциация)?, без ассоциации ЛНП не проявляют выраженные атерогенные свойства. Впоследствии эта гипотеза была подтверждена многими исследователями, изучающими захват клетками ЛНП, ассоциация которых была инициирована in vitro разными способами: интенсивное встряхивание или вортексирование (Walters MJ, 2010), окисление медью и железом (Satchell L, 2012; Saputri FC, 2012), обработка гипохлоритом (Guha M, 2010), миелопероксидазой (Панасенко ОМ, 2004), фосфолипазой А2 (Yamamoto K, 2011), сфингомиелиназой (Sneck M, 2012), протеазами (Piha M, 1995), гликозидазами (Панасенко ОМ, 2006). Тем не менее, в крови больных атеросклерозом так и не удалось обнаружить липопротеиды, аналогичные модифицированным in vitro.
Ранее в работах А. Н. Орехова и В. В. Тертова в крови больных ишемической болезнью сердца были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (цмЛНП) (Orekhov AN et al., 1989; Tertov VV et al., 1990), значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам, в частности, они имели пониженное содержание сиаловой кислоты, маннозы и других сахаров. Примерно в то же время другими исследователями были обнаружены так называемые мелкие, плотные (La Belle M et al., 1990; Avogaro P et al., 1991) и электроотрицательные (Avogaro P et al., 1988) ЛНП, которые, как выяснилось позже, по сути представляют собой наряду с цммЛНП одну и ту же подфракцию близких по свойствам липопротеидных частиц, подвергшихся множественной модификации in vivo (Тертов et al., 1999). Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП обладали двумя общими свойствами:
6
стимулировали липоидоз на клеточном уровне и проявляли склонность к ассоциации, причем, их атерогенный потенциал напрямую зависел от устойчивости к ассоциации и увеличивался с ее понижением (Orekhov AN et al., 1991 а; Tertov VV et al., 1990; Tertov VVetal., 1992 ).
Однако оставались не вполне понятными механизмы атерогенной модификации ЛНП и её роль в атерогенезе. Оставались без ответа многие вопросы. В частности, какие именно изменения должны произойти в частице ЛНП, чтобы она потеряла устойчивость к самоассоциации? Каков механизм ассоциации ЛНП? Как зависит эффективность поглощения клеткой частиц ЛНП от их размера? Отличается ли клеточный метаболизм ассоциатов ЛНП от неассоциированных частиц ЛНП? Можно ли повлиять на процесс ассоциации липопротеидов?
Известно, что ЛНП способны не только к самоассоциации, но к ассоциации с компонентами внеклеточного матрикса (Soto Y, 2012) и образованию циркулирующих иммунных комплексов (Lopes-Virella MF, 2013; Tertov V.V., 1996). Но как сам процесс ассоциации, так и атерогенные свойства ассоциатов изучены недостаточно. Циркулирующие иммунные комплексы могут служить маркерами предрасположенности к инфаркту миокарда (Lopes-Virella MF, и др., 2012), но неизвестно, насколько велика прогностическая и диагностическая роль этого параметра. Не была разработана тест-система для оценки атерогенного потенциала крови больного на основе измерения показателей атерогенной модификации ЛНП. Учитывая это, цели и задачи настоящей работы были сформулированы следующим образом:
7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения является внутриклеточное и внеклеточное отложение липидов, преимущественно эфиров холестерина, в интиме сосудов (Windecker S, 2013; Quarles, 2013; Аничков, 1947). Образование наполненных липидными включениями пенистых клеток является инициирующим моментом патогенеза атеросклероза, однако, механизмы накопления внутриклеточных липидов изучены недостаточно.
Было установлено, что источником липидов, накапливающихся в клетках сосудов, являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП), циркулирующие в крови человека (Bates SR, 1976; Goldstein JL, 1979 ). Частица ЛНП состоит из гидрофобного ядра, которое покрыто оболочкой из фосфолипидов, холестерина и одной молекулы апо-В-100. Каждая частица ЛНП содержит примерно 1600 молекул этерифицированного холестерина, 700 молекул фосфолипидов, 600 молекул неэтерифицированного холестерина и 170 молекул триглицеридов (Davis HR Jr, 2011; Esterbauer H, 1992). Фосфолипиды представлены в-основном фосфатидилхолином (500 молекул) и сфингомиелином (200 молекул). Установлено, что апо-В-100 связывается в основном с молекулами фосфатидилхолина (Greig FH, 2012; Dominiczak MH, 2011; Ghesquiere SA, 2005), в то время как холестерин в большей степени связывается со сфингомиелином (Nilsson A, 2006).
Было показано, что инкубация нативных ЛНП с различными типами клеток не приводит к накоплению липидов (Kruth, 2011; Oomi K, 2006). Причиной служит то, что они попадают в клетку через специфические ЛНП-рецепторы, которые обладают механизмом отрицательной обратной связи (Armengol C, 2013; Goldstein JL, 1977). 8
Это дает возможность клетке регулировать ее внутриклеточное содержание холестерина. При обследовании больных с семейной гиперхолестеринемией, при которой наблюдается частичное или полное отсутствие специфических ЛНП-рецепторов, было показано, что липопротеиды низкой плотности все же попадают в клетки и накапливаются, образуя пенистые клетки. В поиске альтернативных рецепторов Браун и Гольдштейн (Armengol C, 2013; Goldstein JL, 1979) обнаружили рецептор для ацетилированных ЛНП или скэвенджер-рецептор, через который осуществляется
неконтролируемый захват ЛНП клетками. Позднее было показано, что ацетил-ЛНП-рецептор - один из многих так называемых скэвенджер-рецепторов, присутствующих у макрофагов и других типов клеток (Krieger , 2001; Mineo C, 2012). Скэвенджер-рецепторы к ацетилированным ЛНП подразделяются на А1 и А2 (Kodama T, 1990 ). Известно также, что другие рецепторы, такие как CD68, CD36, SR-B1 и LOX-1, проявляют те же свойства, что и скэвенджер-рецепторы (Krieger , 2001). Недавно группой Зу (Xia F, 2013) было показано, что поглощение модифицированных липопротеинов, таких как окисленные ЛНП, происходит посредством CD36-рецептора, и IRGM1, играет важную роль в актин-зависимом CD36 опосредованным поглощении окисленных ЛНП макрофагами. IRGM/IRGM1 эксперессируются макрофагами вокруг атеросклеротической бляшки и их количество зависит от уровня окисленных ЛНП как in vitro, так и in vivo. Кроме того удаление IRGM/IRMG1 значительно снижает захват окисленных ЛНП макрофагами, как у мышей, так и у человека. Кроме того, IRGM1-нокаутные мыши характеризуются нарушениями интернализации CD36 макрофагов, что связано с дефицитом полимеризации ц-актина. Эти результаты продемонстрировали новую функцию IRGM1 в
9
регулировании поглощения макрофагами окисленных ЛНП при атеросклерозе.
Семейная гиперхолестеринемия - достаточно редкое заболевание. В гомозиготной форме им болеет 1 человек на миллион, в гетерозиготной - 1 человек на 300 тысяч. Атеросклероз же наблюдается у каждого мужчины после сорока лет и у большинства женщин после наступления менопаузы. Следовательно, накопление липидов в интиме сосудов нельзя объяснить наличием скэвенджер-рецепторов, так как нативные ЛНП попадают в клетку через специфические апоВ,Е-рецепторы, а не через скэвенджер-рецепторы (Cianciola NL, 2011). Была выдвинута гипотеза о необходимости изменений свойств ЛНП в результате некой химической модификации, обязательной для того, чтобы произошло накопление липидов в клетках.
В интиме артерий и кровеносном русле существуют протеолитические и липолитические ферменты, способные модифицировать ЛНП. Во внеклеточном пространстве интимы были обнаружены химаза и триптаза, две нейтральные протеазы, секретируемые тучными клетками (Kovanen, 2007; Kaartinen M, 1994), металлопротеиназы, секретируемые макрофагами и
гладкомышечными клетками (Packard RR, 2008; Galis ZS, 1994), плазмин (Suzuki, 2010; Grainger DJ, 1994) и тромбин (Kassel KM, 2012; Smith E, 1996).
Во внеклеточном матриксе интимы присутствуют фосфолипаза А2 (Ghesquiere SA, 2005; Plihtari R, 2010; Yamamoto K, 2011) и сфингомиелиназа (Nilsson A, 2006; Plihtari R, 2010; Marathe GK, 2000). Фосфолипаза А2 гидролизует фосфатидилхолин ЛНП (Yamamoto K, 2011), сфингомиелиназа при кислых значениях рН гидролизует
10
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
