Оптическая спектроскопия: сложные молекулы

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

Е.А. Слюсарева
М.А. Герасимова
Н.В. Слюсаренко

ОПТИЧЕСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ:

СЛОЖНЫЕ МОЛЕКУЛЫ

Учебное пособие

Красноярск

СФУ
2018

УДК 535(07)
ББК 22.3я73

С498

Рецензенты:

В.В. Салмин, доктор физико-математических наук, заведующий 

кафедрой медицинской и биологической физики Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. ВойноЯсенецкого;

В.Н. Черепанов, доктор физико-математических наук, заведующий 

кафедрой оптики и спектроскопии физического факультета Национального исследовательского Томского государственного университета

Слюсарева, Е.А.

С498 Оптическая спектроскопия: сложные молекулы : учеб. пособие / 

Е.А. Слюсарева, М.А. Герасимова, Н.В. Слюсаренко. – Красноярск : 
Сиб. федер. ун-т, 2018. – 116 с.

ISBN 978-5-7638-3941-8

Рассмотрены актуальные научно-практические задачи в области абсорбци
онной и флуоресцентной спектроскопии сложных молекул. Приведен углубленный теоретический материал, необходимый для понимания физики процессов, описаны технические детали проведения эксперимента.

Предназначено для студентов магистратуры направления подготовки 

16.04.01 «Техническая физика», профиль «Оптическая физика и квантовая 
электроника», и смежных специальностей, а также может быть полезно преподавателям вузов и специалистам в области молекулярной спектроскопии, материаловедения, биофотоники.

УДК 535(07)
ББК  22.3я73

Электронный вариант издания см.:
http:/catalog.sfu-kras.ru

© Сибирский федеральный

ISBN 978-5-7638-3941-8 
университет, 2018

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ..........................................................................................................................6

I. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ СЛОЖНЫХ МОЛЕКУЛ..............................8

ГЛАВА 1. КОНЦЕНТРАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ В СПЕКТРАХ ПОГЛОЩЕНИЯ 
КРАСИТЕЛЕЙ ..................................................................................................................8

1.1. Основные измеряемые параметры поглощения ....................................................8

1.2. Ошибки определения оптической плотности (пропускания) от величины 
пропускания...................................................................................................................9

1.3. Механизмы ассоциации красителей.....................................................................10

1.4. Расчет степени ассоциации красителя.................................................................14

Практическая задача....................................................................................................16

Контрольные вопросы и задания ................................................................................18

ГЛАВА 2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ 
РАСТВОРОВ ПО ИХ ЭЛЕКТРОННЫМ СПЕКТРАМ ПОГЛОЩЕНИЯ.....................19

2.1. Принцип проведения количественного анализа..................................................19

2.2. Факторы, которые необходимо учитывать при проведении количественного 
спектрального анализа.................................................................................................19

2.3. Определение концентрации отдельных компонентов смеси..............................23

Практическая задача....................................................................................................26

Контрольные вопросы и задания ................................................................................27

II. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ СЛОЖНЫХ МОЛЕКУЛ........................28

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ СПЕКТРАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ 
ПОГЛОЩЕНИЯ И ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ.......................................................................28

3.1. Люминесценция и флуоресценция.......................................................................28

3.2. Спектральные закономерности поглощения и флуоресценции..........................29

3.3. Количественное определение флуоресцирующего вещества в растворе...........32

3.4. Реабсорбция флуоресценции................................................................................33

Практическая задача....................................................................................................36

Контрольные вопросы и задания ................................................................................38

ГЛАВА 4. ПРАВИЛО ЗЕРКАЛЬНОЙ СИММЕТРИИ СПЕКТРОВ 
ПОГЛОЩЕНИЯ И ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ.......................................................................39

4.1. Образование полос поглощения и испускания сложных молекул .....................39

4.2. Количественная связь между спектральными характеристиками 
поглощения и флуоресценции.....................................................................................41

4.3. Корректное представление кривых спектрального распределения 
интенсивности..............................................................................................................44

4.4. Экспериментальная проверка правила зеркальной симметрии Левшина ..........45

Практическая задача....................................................................................................47

Контрольные вопросы и задания ................................................................................48

ГЛАВА 5. ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ. 
КВАНТОВЫЙ ВЫХОД..................................................................................................50

5.1. Фотофизические процессы в молекулах..............................................................50

5.2. Основные параметры флуоресценции .................................................................52

5.3. Абсолютный квантовый выход флуоресценции..................................................56

5.4. Определение относительного квантового выхода флуоресценции ....................57

5.5. Факторы, влияющие на точность определения квантового выхода ...................60

Практическая задача....................................................................................................62

Контрольные вопросы и задания ................................................................................64

ГЛАВА 6. ТУШЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ.................................................................66

6.1. Процессы дезактивации возбужденного состояния, приводящие 
к тушению флуоресценции .........................................................................................66

6.2. Кинетика Штерна – Фольмера .............................................................................68

6.3. Динамическое (столкновительное) тушение .......................................................70

6.4. Процессы, контролируемые диффузией ..............................................................73

6.5. Статическое тушение............................................................................................74

6.6. Тушение флуоресценции тяжелыми атомами .....................................................77

Практическая задача....................................................................................................78

Контрольные вопросы и задания ................................................................................80

ГЛАВА 7. ПОЛЯРИЗАЦИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ........................................................81

7.1. Понятие поляризации флуоресценции.................................................................81

7.2. Анизотропия и степень поляризации флуоресценции ........................................82

7.3. Теория поляризации для разбавленных растворов, находящихся 
в стеклообразном состоянии .......................................................................................83

7.4. Спектры поляризации флуорофоров....................................................................85

7.5. Определение размера излучателя и вязкости раствора по деполяризации 
флуоресценции ............................................................................................................86

7.6. Факторы, влияющие на точность измерения анизотропии флуоресценции.......87

7.7. Магический угол...................................................................................................89

Практическая задача....................................................................................................90

Контрольные вопросы и задания ................................................................................92

ГЛАВА 8. РАЗДЕЛЕНИЕ СЛОЖНОГО СПЕКТРАЛЬНОГО КОНТУРА 
НА СОСТАВЛЯЮЩИЕ .................................................................................................93

8.1. Постановка задачи о разделении сложных контуров..........................................93

8.2. Метод второй производной ..................................................................................94

8.3. Метод анализа приращения функции ..................................................................95

8.4. Метод Аленцева – Фока........................................................................................96

8.5. Метод разложения сложных спектральных контуров с использованием 
стандартных функций..................................................................................................99

Практическая задача..................................................................................................100

Контрольные вопросы и задания ..............................................................................101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................103

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК..............................................................................105

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................................108

Я слышу и забываю.
Я вижу и запоминаю.
Я делаю и понимаю.

Конфуций

ВВЕДЕНИЕ

Становление классических принципов и бурное развитие спектроско
пии пришлось на первую половину прошлого столетия: можно смело 

отнести около трети нобелевских премий по физике к этой области науки. 

Целью учебного пособия является изучение и актуализация оптической 

(абсорбционной и флуоресцентной) спектроскопии сложных молекул 

через решение конкретных научно-практических задач.

Учебное пособие состоит из двух основных разделов: абсорбционная 

и флуоресцентная спектроскопия – и включает в себя восемь глав. Каждая 

глава в целом является тематически независимой, однако для углубленного 

понимания материала в тексте используются перекрестные ссылки на дру
гие теоретические разделы. Глава заканчивается формулировкой актуаль
ной спектроскопической задачи и списком контрольных вопросов и зада
ний. Библиографический список содержит как классические монографии, 

так и оригинальные современные работы, опубликованные в значимых про
фильных научных журналах, которые могут быть использованы для полу
чения дополнительной информации. Выполнение предложенных практиче
ских заданий позволит студентам закрепить теоретические знания в области 

спектроскопии сложных молекул и сформировать компетенции, связанные 

с их использованием для решения прикладных задач.

Практические задания максимально приближены к исследователь
скому уровню: подразумевают многообразие объектов исследования и воз
можность выполнения заданий разного уровня сложности – от стандартного 

до самого высокого (рекомендован студентам с близким профилем научно
исследовательской работы). Пробоподготовка и спектральные исследова
ния выполняются на современном спектральном оборудовании лаборатории 

биофотоники СФУ. В пособии приведена необходимая техническая инфор
мация по используемым приборам (см. прил. 1, 2) и справочные данные 

по красителям (см. прил. 3).

Учебное пособие подготовлено коллективом авторов, имеющим 

большой опыт в области исследования спектральных свойств красителей 

в российских и зарубежных научных центрах в приложении к оптической 

записи информации и биосенсорике. Учебное пособие предназначено для 

студентов магистратуры, обучающихся по направлению 16.04.01 «Техниче
ская физика» профиля «Оптическая физика и квантовая электроника» 

и смежных специальностей, а также может быть полезно преподавателям 

вузов и специалистам в области молекулярной спектроскопии, материало
ведения, биофотоники.

I. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ

СЛОЖНЫХ МОЛЕКУЛ

ГЛАВА 1. КОНЦЕНТРАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ В СПЕКТРАХ 

ПОГЛОЩЕНИЯ КРАСИТЕЛЕЙ

1.1. Основные измеряемые параметры поглощения

Основой абсорбционной (поглощательной) спектроскопии является 

закон Бугера – Ламберта – Бера (рис. 1.1), отражающий количественную 

связь между относительной величиной интенсивности светового потока, 

прошедшего через образец, пропускания 
,

T
и концентрацией растворен
ного вещества С:

l
С

I
I
T








10

0

,
(1.1)

где 
0I
и
I
– интенсивности падающего 

и прошедшего монохроматического свето
вого потока (то есть величины, зависящие 

от длины волны ) через слой вещества тол
щиной l. Величина 
,


зависящая от длины 

волны 
монохроматического 
излучения, 

называется десятичным показателем погло
щения на единицу концентрации вещества. 

Если концентрация выражена в молях на литр (М), а толщина слоя 

в сантиметрах (см), то 


называют молярным десятичным коэффициен
том экстинкции. Выражение (1.1) можно переписать в следующем виде:

l
С
T
I
I
D










1
lg
lg
0
,
(1.2)

Рис. 1.1. Иллюстрация к закону 

Бугера – Ламберта – Бера

где 

D носит название оптической плотности (в англоязычной литературе 

A от «Аbsorbance»).

Используя спектрофотометр (прил. 1), можно измерить величину про
пускания T или оптическую плотность раствора 
.

D
Зная условия экспери
мента (молярную концентрацию красителя в растворе и оптический путь в 

кювете), легко рассчитать 
.


Эта спектральная величина характеризует по
глощательную способность вещества и не зависит от его концентрации. Од
нако коэффициент 
,


измеренный для высоких концентраций поглощаю
щего вещества, может отличаться от измеренного для его низких концен
траций. Это может быть обусловлено проявлением одного или сразу 

обоих факторов [1–5]:

1) измерительная погрешность спектрофотометрических измерений;

2) ассоциация красителей.

Закон Бугера – Ламберта – Бера может быть записан иначе, чем в виде 

(1.1), например, с помощью экспоненциальной зависимости пропускания 

от произведения толщины l (см) поглощающего вещества, его концентра
ции N
)
см
(
3

и сечения поглощения 

 (см2):

l
N
e
T



 
.
(1.3)

Последнее выражение отражает закон поглощения света, а величины N

и C, а также 


и 


взаимно однозначно выражаются друг через друга. 

В дальнейшем индекс «» иногда будет опущен для I, D,  и .

1.2. Ошибки определения оптической плотности

(пропускания) от величины пропускания

Весьма существенным при спектрофотометрических измерениях яв
ляется учет зависимости ошибки определения оптической плотности (или 

пропускания) от величины пропускания. Если точность определения опти

ческой плотности связана только с погрешностями измерений интенсивно
стей падающего 0I и прошедшего I световых потоков и эти погрешности 

одинаковы для обоих потоков, то, используя (1.1), (1.2), можно получить 

формулу для относительной ошибки






 






0
0
0

0

/
1
1
/
lg

434
,0

I
I
I
I
I
I

D
D
.
(1.4)

На рис. 1.2 представлена зависимость 

отношения 
0
0 /
:
/
I
I
D
D


от величины 

пропускания. Наибольшая точность измере
ний может быть достигнута при значениях 

пропускания 
образцов, 
заключенных 

в пределах ~9–58 % (что соответствует ин
тервалу оптической плотности от 0,24 

до 1,05). Для образцов с оптической плотно
стью вне этого интервала ошибка измере
ний резко возрастает. Формула (1.4) была 

получена для однолучевой спектрофото
метрии, когда ошибка связана с измерением 

как 
,
0I
так и I. При использовании двухлу
чевой (разностной) спектрофотометрии, когда происходит измерение вели
чины 
0I
I
(прил. 1), точность измерения возрастает и допустимыми явля
ются измерения оптических плотностей до 1,6 ед. Современные спектрофо
тометры имеют динамический интервал измерения до 4–6 ед. оптической 

плотности, однако достоверность измерения высоких оптических плотно
стей по рассмотренным причинам достаточно низкая.

1.3. Механизмы ассоциации красителей

При увеличении концентрации вещества в растворе происходит сбли
жение его молекул, приводящее к развитию сильного межмолекулярного 

Рис. 1.2. Относительная 

погрешность спектрофотомет
рических измерений

взаимодействия. Этот процесс часто сопровождается объединением сосед
них молекул с образованием агрегатов различной сложности
[1; 3]. 

В результате в растворе наряду с мономерными одиночными молекулами 

появляются новые поглощающие центры. Их возникновение оказывает 

очень существенное воздействие на оптические свойства вещества.

Особенно сильно процессы молекулярной ассоциации проявляются 

в растворах различных красителей – веществ, имеющих интенсивную по
лосу поглощения в видимой части спектра и обладающих красящими свой
ствами. Наиболее благоприятной средой для образования ассоциатов 

красителей является вода. В чистых полярных органических растворителях 

(спиртах, ацетоне, пиридине и др.) ассоциация молекул красителей либо 

вовсе не развивается, либо начинает слабо проявляться лишь в самых 

концентрированных растворах. У ряда красителей процесс молекулярной 

ассоциации резко усиливается при помещении их в бинарные смеси поляр
ных и неполярных растворителей (хлороформ с CCl4, различных спиртов 

с CCl4 и др.). В практически неполярных средах, где полярный компонент 

составляет лишь несколько процентов бинарной смеси, ассоциация молекул 

красителей происходит очень эффективно. Процесс ассоциации суще
ственно увеличивается и при сильном увеличении вязкости раствора, 

которое происходит при значительном его охлаждении и последующем 

замораживании.

Процесс ассоциации является обратимым. Все концентрационные эф
фекты полностью исчезают, а первоначальные оптические свойства раство
ров, содержащих лишь мономерные молекулы исследуемого вещества, 

полностью восстанавливаются при обратном разведении концентрацион
ных растворов. Нагревание концентрированных растворов также способ
ствует уменьшению ассоциации. Это указывает на малую прочность обра
зующихся ассоциатов, объединение молекул красителей в которых проис
ходит без возникновения сильных химических связей между ними.

Объединение молекул красителей в ассоциаты очень часто осуществ
ляется при помощи водородных связей. Возможность их возникновения 

определяется структурой взаимодействующих молекул и свойствами окру
жающей среды. После образования водородных связей входящие в ассоциат 

молекулы располагаются в непосредственной близости друг от друга. Это 

способствует развитию сильного взаимодействия между ними, которое 

и вызывает наблюдаемые на опыте деформации их электронных спектров 

поглощения. Другим механизмом ассоциации красителей является гидро
фобный механизм, являющийся следствием термодинамической невыгод
ности контакта молекул с водой [4].

Вместе с тем способ закрепления молекул красителей друг около 

друга очень мало сказывается на характере спектральных изменений. Для 

их возникновения важно лишь, чтобы эти молекулы достаточно долгое 

время находились в непосредственной близости на расстоянии не более 

1 нм. В этом отношении непосредственное объединение молекул краси
телей в ассоциаты является лишь одним из таких способов. Другой способ 

состоит в введении в растворы красителей высокомолекулярных веществ, 

при которых происходят также весьма значительные деформации спек
тров поглощения. В этом случае молекулы красителя взаимодействуют

с активными группами полимера, расположенными на совершенно опре
деленных расстояниях друг от друга. В результате получается строго 

упорядоченная система молекул красителей, закрепленных на поверхно
сти полимера. Это приводит к развитию взаимодействия между ними, 

сопровождающегося возникновением деформаций их спектров поглоще
ния. Величина этих деформаций зависит от строения полимера и, прежде 

всего, от расстояния между его активными группами, которые и опреде
ляют расстояние между молекулами красителя, а следовательно, и силу 

взаимодействия между ними.

Об образовании ассоциированных молекул можно, прежде всего, су
дить по деформациям видимой электронной полосы поглощения исследуе
мого красителя. Характер происходящих при этом изменений виден 

на рис. 1.3, где показаны концентрационные деформации электронного 

спектра сечения поглощения красителя родамина 6G в воде. Спектр погло
щения практически не изменяется в области малых концентраций раствора 

(до ~106 М). Следовательно, в этом диапазоне концентраций образования 

ассоциированных молекул не происходит, и наблюдаемый спектр поглоще
ния принадлежит мономерным молекулам красителя. 

Рис. 1.3. Спектры поглощения водных растворов

родамина 6G различных концентраций [5]

При дальнейшем возрастании концентрации наблюдается интенсив
ное уменьшение длинноволновой мономерной полосы поглощения 

(λМ = 530 нм) и одновременное появление и быстрое нарастание новой 

коротковолновой полосы (λД = 500 нм), принадлежащей возникающим 

в растворе ассоциированным молекулам красителя. Из рисунка видно, что 

все семейство спектров поглощения пересекается в одной точке, которая 

носит название изобестической точки. Наличие изобестической точки ука
зывает на то, что исследуемый раствор представляет собой бинарную смесь