Молекулярная биология и генная инженерия

Министерство образования и науки Российской Федерации 
Сибирский федеральный университет 
 
 
 
 
 
 
 
Т.Н. Субботина, П.А. Николаева, А.Е. Харсекина 
 
 
МОЛЕКУЛЯРНАЯ  БИОЛОГИЯ  
И  ГЕННАЯ  ИНЖЕНЕРИЯ 
 
Практикум 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Красноярск 
СФУ 
2018 
 

УДК 577.21(07) 
ББК 28.070я73 
         С890 
 
 
 
 
 
 
Р е ц е н з е н т ы: 
Т.В. Наседкина, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН; 
Ю.В. Гуляева, кандидат биологических наук, заведующий онкологическим отделением иммунологии Республиканского научно-практического 
центра онкологии и медицинской радиологии имени Н.Н. Александрова 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Субботина, Т.Н. 
С890     Молекулярная биология и генная инженерия : практикум /             
Т.Н. Субботина, П.А. Николаева, А.Е. Харсекина. – Красноярск : 
Сиб. федер. ун-т, 2018. – 60 с. 
ISBN 978-5-7638-3857-2 
 
Приведены практические работы и ситуационные задачи по темам «Мутации и полиморфизмы», «Биологический материал для проведения анализа 
нуклеиновых кислот», «Молекулярно-генетические методы выявления мутаций 
и полиморфизмов», «Генная инженерия». 
Предназначен для студентов, обучающихся по направлению 06.04.01 
«Биология», магистерская программа 06.04.01.05 «Реконструктивная биоинженерия». 
 
 
Электронный вариант издания см.: 
http://catalog.sfu-kras.ru 
УДК 577.21(07) 
ББК 28.070я73 
 
ISBN 978-5-7638-3857-2                                                           © Сибирский федеральный  
                                                                                                         университет, 2018 

ОГЛАВЛЕНИЕ 
 
СПИСОК  СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................ 4 
ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... 5 
Т е м а  1. МУТАЦИИ  И  ПОЛИМОРФИЗМЫ.  РАБОТА  
                 С  ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ  
                 НУКЛЕИНОВЫХ  КИСЛОТ ............................................................ 7 
1.1. Поиск нуклеотидной последовательности гена  
       (на примере гена CALR) .............................................................................. 7 
1.2. Поиск мРНК гена (на примере гена CALR) ............................................ 10 
1.3. Определение количества экзонов и интронов в составе гена  
      (на примере гена CALR) и поиск нуклеотидной  
       последовательности какого-либо экзона или интрона  
      (например, 9-го экзона гена CALR) .......................................................... 13 
1.4. Просмотр мРНК гена с выделением подсвечиванием отдельно  
       каждого экзона (например, выделение 9-го экзона гена CALR) ........... 18 
1.5. Поиск того нуклеотида в составе геномной ДНК и мРНК,  
       после которого расположены полиморфизм (SNP) или мутация  
с определенным rs (например, мутация c.1154_1155insTTGTC  
       в гене CALR) ............................................................................................... 21 
1.6. Поиск последовательности аминокислот белка,  
       транслированного с интересующего гена (например, CALR) ............... 28 
1.7. Поиск информации о какой-либо мутации  
       или полиморфизме в базе NCBI ............................................................... 35 
1.8. Определение частоты встречаемости какого-либо полиморфизма  
       или мутации в различных популяциях (на примере 
       полиморфизма в гене F5 (фактор Лейдена) rs6025) ............................... 46 
Т е м а  2. БИОЛОГИЧЕСКИЙ  МАТЕРИАЛ  ДЛЯ  ПРОВЕДЕНИЯ  
                 АНАЛИЗА  НУКЛЕИНОВЫХ  КИСЛОТ ..................................... 49 
Тема 3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ  МЕТОДЫ  
ВЫЯВЛЕНИЯ  МУТАЦИЙ  И  ПОЛИМОРФИЗМОВ:  
РЕШЕНИЕ  СИТУАЦИОННЫХ  ЗАДАЧ  
ПО  ИНТЕРПРЕТАЦИИ  РЕЗУЛЬТАТОВ  АНАЛИЗА  
СОМАТИЧЕСКИХ  МУТАЦИЙ  СЕКВЕНИРОВАНИЕМ  
ПО  МЕТОДУ  СЕНГЕРА .................................................................. 52 
 
Тема 4. ГЕННАЯ  ИНЖЕНЕРИЯ:  ИСПОЛЬЗОВАНИЕ  
             ФЕРМЕНТОВ  РЕСТРИКТАЗ  ДЛЯ  ВЫЯВЛЕНИЯ  
             ПОЛИМОРФИЗМОВ  И  МУТАЦИЙ,  ПЦР/ПДРФ-АНАЛИЗ ...... 56 
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ............................................................. 58 
 
 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 
 
A – adenine 
bp – base pair 
C – cytosine 
CDS – coding DNA sequence 
EXAC – Exome Aggregation Consortium 
G – guanine 
NCBI – National Center for Biotechnology Information 
NGS – Next-Generation Sequencing 
SNP – single nucleotide polymorphism 
T – thymine 
U – uracil 
БД – база данных 
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота 
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота 
ОНП – однонуклеотидные полиморфизмы 
ПДРФ-анализ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 
ПО – программное обеспечение 
ПЦР – полимеразная цепная реакция 
РНК – рибонуклеиновая кислота 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ 
 
 
Практикум «Молекулярная биология и генная инженерия», предназначенный для студентов, обучающихся по направлению 06.04.01 «Биология», профиль 06.04.01.05 «Реконструктивная биоинженерия», призван оптимизировать освоение дисциплины. Представленный материал необходим 
студентам для оформления отчета по самостоятельной работе, при написании которого они должны уметь применить полученные знания и навыки 
поиска ассоциаций между изменениями в структуре ДНК и функциональными свойствами выбранных белков. 
Преподавание молекулярной биологии целесообразно на протяжении 
всей программы подготовки будущих врачей-биологов и специалистовисследователей, включая бакалавриат, магистратуру и аспирантуру. Однако в большинстве вузов молекулярно-генетическое образование ограничивается только некоторыми разделами, которые входят в курсы по таким 
фундаментальным наукам, как генетика, биохимия, молекулярная биология, и значительный процент студентов, практикующих врачей-биологов 
и преподавателей мало знакомы с современными достижениями молекулярной медицины, медицинской генетики и возможностью их клинического 
использования. 
В то же время в последние десятилетия наблюдается прогресс биологии и медицины, что обусловлено успехами в области медицинской генетики и молекулярной медицины. В настоящее время проводится планомерный поиск ассоциаций между различными патологическими состояниями человека и особенностями генома. Это, в свою очередь, ведет к более 
глубокому пониманию представлений о молекулярных основах этиологии 
и патогенеза заболеваний. Также активно совершенствуются молекулярногенетические технологии, что позволяет как изучать состояние генов  (наличие мутаций) у отдельного человека, так и исследовать закономерности 
развития нормальных и патологических процессов на уровне генома. Всё 
это помогает развитию персонифицированной медицины. 
В первой теме практикума представлена информация о возможностях 
использования современных молекулярных баз данных (БД), расположенных на платформе NCBI (National Center for Biotechnology Information),  
таких как Nucleotide, Protein, Gene, dbSNP, GenBank и др., с целью получения студентами навыков и знаний о поиске мест локализаций мутации 
в гене, мРНК, экзоне и другой информации об анализируемом участке 
ДНК (РНК), что, в свою очередь, очень важно для оценки взаимосвязи          
генотипа и фенотипа, т. е. влияния мутации на развитие заболевания или 
прогноз его течения. 

Во второй и третьей темах рассмотрены подходы к решению основных типов ситуационных задач, с которыми сталкивается как врач-биолог, 
так и любой исследователь. В частности, даны примеры решения задач по 
проведению расчётов, необходимых для приготовления и разведения реагентов в ходе использования молекулярно-генетических методик, а также 
по интерпретации результатов анализа герминальных и соматических мутаций секвенированием по методу Сенгера. 
В четвертой теме изучен метод ПЦР/ПДРФ-анализа как один из методов, часто применяемых для анализа полиморфизмов и мутаций в геноме 
человека. 
Практикум подготовлен в соответствии с рабочей программой дисциплины «Молекулярная биология и генная инженерия». 
На обложке приведена секвенограмма, отражающая результат анализа 
мутаций в гене ASXL1 у пациента с онкогематологическим заболеванием. 
В частности, стрелкой показано место расположения новой соматической 
мутации c.1772_1773insAA; p.Y591fs*1 в 13-м экзоне гена ASXL1. В настоящее время  в базе COSMIC (онлайн-база соматических мутаций)          
информация о такой мутации отсутствует. Данная мутация, как и другие 
в анализируемой области гена ASXL1, имеет для пациента неблагоприятное прогностическое значение, а потому выявление такой мутации должно 
учитываться врачами-гематологами при назначении пациенту терапии. 
Процесс секвенирования проведен на генетическом анализаторе          
AB 3500 на базе научно-практической лаборатории молекулярно-генетических 
методов исследований СФУ. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Т е м а  1 
 
МУТАЦИИ  И  ПОЛИМОРФИЗМЫ. РАБОТА  
С  ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ  
НУКЛЕИНОВЫХ  КИСЛОТ 
 
 
1.1. Поиск нуклеотидной последовательности гена  
(на примере гена CALR) 
 
Теоретические сведения 

В конце прошлого и начале текущего столетия геном человека был 
расшифрован и для большинства хромосом были составлены цитогенетические карты. Всю полученную информацию можно получить при обращении 
к соответствующим базам данных. Ген – структурная и функциональная 
единица наследственности живых организмов. На сегодняшний день известно 
примерно 25 тыс. генов, которые кодируют информацию о структуре белков 
и РНК в геноме человека. Ген состоит из последовательности нуклеотидов: 
аденина (А), тимина (Т), гуанина (G) и цитозина (С). Поиск нуклеотидной 
последовательности гена – необходимый этап работы любого специалиста, 
работающего в области молекулярной биологии. Умение работы с последовательностью гена нужно, например, при подборе праймеров с целью 
дальнейшей оценки интересующего фрагмента ДНК на предмет наличия 
мутаций или каких-либо специфических последовательностей в гене (промоторы, стоп- и старт-кодоны, полиА-последовательности и др.). 
Ниже приведен пример тех действий, с помощью которых можно 
найти последовательность интересующего нас гена. 
 
Ход работы 

Зайти на сайт базы NCBI. В левом окне выбрать «Gene», в правом 
окне написать общепринятое название нужного гена на английском языке 
(например, CALR) и кликнуть «Search» (рис. 1.1). 
В окне будут показаны ссылки на данный ген для разных организмов 
и их ID. Также здесь указаны номер хромосомы, на которой локализован 
данный ген и номера нуклеотидов, соответствующих расположению гена 
на этой хромосоме. В частности, выбираем вариант гена CALR для человека (Homo sapiens (human)). ID этого гена в геноме человека – 811. Номер 
хромосомы, на которой расположен ген, – 19. Номера нуклеотидов гена 
в хромосоме: 12938600–12944490. Но при работе с этой нумерацией обязательно нужно учитывать, что она соответствует определенному номеру сиквенса данной хромосомы (NC). Так, в приведенном примере вариант сиквенса – это NC_000019.10. 

Рис. 1.1 

 
Рис. 1.2 

 
Рис. 1.3 

Далее нужно кликнуть на вариант гена CALR для человека (Homo 
sapiens (human) – см. рис. 1.2. 
В появившемся окне кликнуть на «Full Report» и выбрать «Gene 
Table» (рис. 1.3). 
Далее кликнуть закладку «GenBank» (рис. 1.4). 
В появившемся окне представлена последовательность гена CALR 
(рис. 1.5). 
 

 
Рис. 1.4 
 

 
Рис. 1.5 
 
Последовательность искомого гена дана в виде перечня нуклеотидов 
только одной цепи ДНК в направлении 5’→3’. Нуклеотиды представлены 
по 10 шт. в каждом столбце и по 6 столбцов в каждой строке. Нумерация 
нуклеотидов сквозная, независимо от места расположения стартового кодона и начала экзонов и интронов. 
 
 

1.2. Поиск мРНК гена (на примере гена CALR) 
 
Теоретические сведения 

мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота) – это РНК, которая содержит информацию о первичной структуре белков. мРНК синтезируется 
на основе ДНК в ходе транскрипции, после чего используется в ходе 
трансляции как матрица для синтеза белков. Таким образом, мРНК играет 
важную роль в экспрессии генов. Умение находить нуклеотидную последовательность мРНК гена необходимо, например, при подборе праймеров 
на участок мРНК с целью качественной или количественной оценки экспрессии генов. 
Ниже приведен пример тех действий, с помощью которых можно 
найти последовательность мРНК интересующего нас гена. 
 
Ход работы 

Зайти на сайт базы NCBI. В левом окне выбрать «Gene», в правом 
окне написать общепринятое название нужного гена на английском языке 
(например, CALR) и кликнуть «Search» (рис. 1.6). 
 

 
Рис. 1.6 
 
Найти вариант гена CALR для человека (Homo sapiens (human)) и 
кликнуть его (рис. 1.7). 
Далее нажать «Full Report» и выбрать «Gene Table» (рис. 1.8). 
В появившемся окне представлен единственный для данного гена 
вариант мРНК с соответствующим номером NM_004343.3 (рис. 1.9). 
 
 

Рис 1.7 
 

 
Рис. 1.8 
 

 
Рис. 1.9