Генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота

ФГБОУ ВПО «КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМЕНИ Н.Э. БАУМАНА»

На правах рукописи

ШАЕВА

АЙГУЛЬ ЮСУПОВНА

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.01.04 – Биохимия

06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,  

микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Н.З.

Научный консультант:

доктор биологических наук 

Вафин Р.Р.

Казань – 2011

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….…….6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………….10

1.1. Лейкоз крупного рогатого скота…………………………………………...10

1.2. Вирус лейкоза крупного рогатого скота…………………………………..11

1.2.1. Состав и структура вириона………………………………………...11

1.2.2. Геном вируса…………………………………………………………12

1.3. Патогенез лейкоза крупного рогатого скота………………………………17

1.4. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота………………………...19

1.4.1. Эпизоотическое состояние по лейкозу крупного рогатого скота

в Российской Федерации……………………………………………20

1.4.2. Эпизоотическое состояние по лейкозу крупного рогатого скота

в Республике Татарстан…………………………………………......21

1.5. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота……………….....23

1.5.1. Реакция иммунодиффузии (РИД)………………………………......23

1.5.2. Иммуноферментный анализ (ИФА)………………………………..24

1.5.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)……………………………...25

1.5.4. ПЦР-ПДРФ-анализ………………………………………………......27

1.5.5. Секвенирование...................................................................................28

1.5.6. Филогенетический анализ…………………………………………..31

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………….........32

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………………….32

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………..45

3.1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота

в Республике Татарстан……………………………………………………45

3.1.1. Результаты серологических и гематологических исследований 

крупного рогатого скота за 2006-2010 гг…………………………..45

3.1.2. Степень инфицированности крупного рогатого скота в разрезе 

районов Республики Татарстан по состоянию на 2010 год…….....45

3.2. Стратегии типизации ВЛКРС, основанные на интерпретации

env-ПЦР-ПДРФ-профилей…………………………………………………47

3.2.1. Интерпретация env-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV

по D. Beier et al. (2001)……………………………………………...48

3.2.2. Интерпретация env-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV

по M. Licursi et al. (2002)……………………………………………50

3.2.3. Интерпретация env-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV

по H. Fechner et al. (1997)…………………………………………...52

3.3. Стратегия типизации BLV на основе интерпретации результатов  

филогенетического анализа локуса env-гена возбудителя………………54

3.4. Классификация заявленных в GenBank NCBI представителей BLV

в зависимости от выбранной стратегии типизации……………………...71

3.5. Совершенствование способов генотипической идентификации BLV

по локусу env-гена возбудителя…………………………………………...79

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….112

5. ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….128

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ…………………………………………129

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………………130

ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………………………………………...146

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AsuHPI – эндонуклеаза рестрикции, из Actinobacillus suis HP.
ВЛКРС – вирус лейкоза крупного рогатого скота.
ГКГ – главный комплекс гистосовместимости.
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота.
ИФА – иммуноферментный анализ.
МА – матриксный белок вируса.
ПААГ - полиакриламидный гель.
ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов.
п.н. – пары нуклеотидов (bp – base pairs).
ПЦР – полимеразная цепная реакция.
РНК – рибонуклеиновая кислота.
иРНК – рибонуклеиновая кислота информационная.  
кДа – килодальтон.
РИД – реакция иммунодиффузии.
BamHI – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный 
ген BamHI из Bacillus amyloliquefaciens H.
BclI – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный ген 
BclI из Bacillus caldolyticus (A. Atkinson).
BglI – эндонуклеаза рестрикции, из Bacillus globigii.
BLV – Bovine Leukemia Virus.
BSA – Bovine Serum Albumin (бычий сывороточный альбумин).
CA – CApsid protein (капсидный белок).
CREB – cAMP response element-binding (клеточный фактор транскрипции).
dATP – deoxyadenosinetriphosphate (дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат).
dCTP – deoxycytidinetriphosphate (дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат).
dH2O – деионизированная вода.
dGTP – deoxyguanosinetriphosphate (дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат).
dNTPs – deoxynucleosidtriphosphates (дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфаты).
dTTP – deoxythymidinetriphosphate (дТТФ – дезокситимидинтрифосфат).
DdeI – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный 
ген DdeI из Desulfovibrio desulfuricans (NCIB 83120).
Env – ген, кодирующий белок оболочки вируса.
Gag – ген, кодирующий белковые компоненты нуклеопротеинового ядра 
вируса.
HaeIII – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный 
ген HaeIII из Haemophilus aegyptius.
HphI – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный 
ген HphI из Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 49700).
HTLV-I – Human T-lymphotropic virus type I (лимфотропный вирус человека 
первого типа).
IN – INtegration protein (белок интеграции).
IgM – Immunoglobulin M (иммуноглобулин М).

Ksp22I – эндонуклеаза рестрикции, из Kurthia species 22.
LTR – Long Terminal Repeat (длинный концевой повтор).
MA – MAtrix protein (матриксный белок).
NC – NucleoCapsid protein (нуклеокапсидный белок).
NCBI – National Center for Biotechnology Information (Национальный Центр
Биотехнологической Информации).
nt. – nucleotide (нуклеотид).
Orf – гены белков с неизвестной функцией.
PHYLIP – PHYLogeny Inference Package (программное обеспечение для 
построения филогенетических деревьев).
PL – Persistent Lymphocytosis (персистентый лимфоцитоз).
Pol – ген полимеразы / обратной транскриптазы вируса.
PR – PRotease (протеаза).
Prt – ген протеазы вируса.
PvuII – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный 
ген PvuII из Proteus vulgaris.
Rex – ген, участвующий в посттранскрипционной регуляии вируса
RFLP – Restriction Fragment Length polymorphism (ПДРФ – полиморфизм длин 
рестрикционных фрагментов).
seq. – sequence (нуклеотидная последовательность).
RT – ReverTase (ревертаза).
SNP – Single Nucleotide Polymorphism (полиморфизм единичных нуклеотидов).
SspI – эндонуклеаза рестрикции, из штамма E.coli несущего клонированный ген
SspI из Sphaerotilus species.
SU – Surface protein (поверхностный белок).
Tax - ген активации вирусной транскрипции.
ТМ – TransMembrane protein (трансмембранный белок).

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота – инфекционная

болезнь опухолевой природы, этиологическим агентом которого является

одноименный вирус (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus, BLV), относящийся к 

роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae (S.M. Rodriguez et al., 2009).

В структуре инфекционных болезней животных лейкоз крупного рогатого 

скота в Российской Федерации занимает ведущее место. Он представляет 

угрозу для генофонда племенного молочного скота, наносит значительный 

экономический ущерб, вследствие
падежа животных и недополучения 

продуктов животноводства (Н.З. Хазипов с соавт., 2008).

Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга 

инфицированности 
стад 
ВЛКРС 
являются 
неразрывным 
звеном 

противолейкозных мероприятий.

Вопросы диагностики лейкоза крупного рогатого скота в контексте 

изучения генетического многообразия его этиологического агента весьма 

актуальны, учитывая факт невозможности типизации данного вирусного 

патогена серологическими методами исследования (G. Moratorio et al., 2010).

Ряд разработанных на основе интерпретации env-ПЦР-ПДРФ-профилей 

стратегий типизации BLV (H. Fechner et al., 1997; D. Beier et al., 2001; M. Licursi

et al., 2002; H. Fechner et al., 1997) имеют определенную идентификационную 

ценность, однако не способны охарактеризовать весь спектр генетического 

многообразия 
ВЛКРС, 
нежели 
современный 
подход 
к 
оценке
его 

генотипического разнообразия на основе филогенетического анализа env-гена

данного возбудителя (S.M. Rodriguez et al., 2009; G. Moratorio et al., 2010).

Цель и задачи исследования. Цель исследования –
молекулярно
генетический анализ представителей ВЛКРС на предмет их таксономической 

классификации в контексте существующих подходов к типизации возбудителя 

и совершенствование способов генотипической идентификации BLV по локусу 

env-гена.

Для реализации цели решались следующие задачи:

 изучить эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота в 

Республике Татарстан;

 установить 
таксономическую 
принадлежность 
изолятов 
ВЛКРС, 

циркулирующих 
в 
хозяйствах 
Республики 
Татарстан, 
в 
контексте 

существующих 
молекулярно-генетических 
подходов 
к 
типизации

возбудителя, как на основе ПЦР-ПДРФ, так и филогенетического анализа 

секвенированных последовательностей локуса env-гена провируса BLV;

 классифицировать всех заявленных в GenBank NCBI представителей ВЛКРС 

в 
зависимости 
от 
выбранной 
стратегии 
типизации
c
дальнейшим 

определением 
степени
согласованности 
существующих 
способов 

генотипической идентификации BLV;

 разработать схему ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС по локусу env-гена 

возбудителя, согласующуюся с филогенетической классификацией BLV.

Научная новизна. 

 Впервые на основании филогенетического анализа секвенированных 

последовательностей локуса env-гена провируса BLV
охарактеризован 

новый, ранее не обоснованный генотип ВЛКРС, обозначенный нами «8-й 

генотип».

 Впервые 
разработана 
схема 
ПЦР-ПДРФ-генотипирования 
BLV
в 

соответствии с филогенетической классификацией данного возбудителя.

Научная новизна отражена в публикациях ведущих рецензируемых 

научных журналов, рекомендованных ВАК и глобальной электронной базе 

данных GenBank NCBI.

Научно-практическая значимость.

 Результаты молекулярно-генетического анализа представителей ВЛКРС на 

предмет их таксономической принадлежности существенно повышают 

уровень знаний о генетическом многообразии BLV и позволяют эффективно 

использовать полученную информацию в научно-практической деятельности 

ветеринарной медицины.

 С учетом новых знаний о генетическом многообразии BLV, разработана 

согласующаяся с филогенетической классификацией схема ПЦР-ПДРФ
генотипирования, позволяющая проводить идентификацию 8-ми генотипов

ВЛКРС.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

 научно­практической 
конференции 
«Становление 
и 
достижения 

биохимической школы Казанского университета (Казань, 2009 г.);

 Международной научно-практической конференция, посвященной 90-летию 

кафедры биологической и органической химии Санкт-Петербургской ГАВМ 

(Санкт-Петербург, 2009 г.);

 VII Всероссийской научно-практической конференции с международным 

участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г.);

 научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО «Казанская 

академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2010);

 научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних 

животных» (Казань, 2010 гг.);

 Международной 
научно-практической 
конференции 
«Инновационные 

подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Tроицк, 2011 г.);

 Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение 

инновационного развития животноводства» (Казань, 2011 г.);

 Научно-технической 
конференции 
«Модернизация 
АПК 
на 
основе 

инновационных достижений науки и техники» (Казань, 2011 г.).

Публикация 
результатов 
исследования. 
По 
теме 
диссертации 

опубликовано 16 работ, в том числе 6 публикаций в ведущих рецензируемых 

научных журналах, рекомендованных ВАК, включая 4 депонированные в 

глобальную 
базу 
данных
GenBank
NCBI
публикации
нуклеотидных 

последовательностей локуса env-гена выявленных изолятов провируса BLV.

Основные положения, выносимые на защиту.

 На основании результатов серологических и гематологических исследований 

поголовья крупного рогатого скота на лейкоз в Республике Татарстан 

установлен эндемический характер распространения данной вирусной 

инфекции.

 На 
основании 
филогенетического 
анализа 
секвенированных 

последовательностей локуса env-гена провируса BLV охарактеризован 

новый, ранее не обоснованный 8-й генотип ВЛКРС, ввиду формирования на 

выстраиваемых 
дендрограммах 
нового 
автономного 
генотипического 

кластера.

 Схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования
ВЛКРС, разработанная в рамках 

совершенствования способов генотипической идентификации возбудителя, 

согласуется с современным подходом к оценке
его генотипического

разнообразия, основанным на филогенетическом анализе env-гена BLV.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 

150 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Office

2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) 

и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 

результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, 

выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 

132 источника, в том числе 93 иностранных) и приложения. Диссертация 

иллюстрирована 29 таблицами, 15 рисунками и 6 схемами. Прилагаются 

документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Лейкоз крупного рогатого скота

Одной
из 
самых 
распространенных 
инфекционных 
патологий

сельскохозяйственных животных, наносящих значительный экономический 

ущерб животноводству, является лейкоз крупного рогатого скота (В.М. Авилов,

В.М. Нахмансон, 1995).

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь

опухолевой природы, основной признак которой - злокачественное разрастание 

клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего 

происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются 

опухоли (В.М. Авилов, В.М. Нахмансон, 1995; В.Н. Сюрин с соавт., 1998; Б.В. 

Камалов  с соавт., 2005).

Болезнь поражает в первую очередь высокопродуктивных коров, а значит,

представляет угрозу для генофонда племенного молочного скота и, при 

отсутствии планомерной борьбы, имеет тенденцию к дальнейшему нарастанию.

Лейкоз крупного рогатого скота наносит значительный экономический ущерб 

вследствие недополучения молока и приплода из-за выбраковки и убоя, 

утилизации лейкозных туш, сдачи на мясо племенного молодняка от больных 

коров и расходов на проведение комплекса мероприятий (В.Н. Сюрин с соавт., 

1998). Разработка эффективных способов борьбы с лейкозом крупного рогатого 

скота является одной из важнейших задач не только ветеринарной медицины, 

животноводства, 
но 
и 
биологии 
и 
экологии 
в 
целом, 
имеющих 

непосредственное отношение к безопасности здоровья человека (Б.В. Камалов  

с соавт., 2005). 

В последние годы болезнь доминирует и занимает одно из первых мест в 

структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота. Лейкоз 

распространен во всех странах мира, в том числе и в Российской Федерации

(Н.З. Хазипов с соавт., 2008; S.M. Rodriguez et al., 2009; G. Moratorio et al., 

2010).

1.2.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота

1.2.1. Состав и структура вириона

Этиологическим агентом лейкоза крупного рогатого скота является РНК
содержащий вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС, англ. Bovine

leukemia virus, BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae

(R.I.B. Francki et al., 1991; D. Beier et al., 2001; H. Fechner et al., 1997; M. Licursi

et al., 2002; G. Moratorio et al., 2010; S.M. Rodriguez et al., 2009).

Зрелые вирионы диаметром от 60 до 125 нм содержат центрально 

расположенный электронно-плотный нуклеоид (J. Ghysdael et al., 1979; N. Gillet

et al., 2007; J.M. Miller et al., 1969). Центральная частъ нуклеоида отделена от 

внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. На поверхности внешней 

оболочки выступают шпильки (пепломеры) с утолщениями на конце, 

образованными 
гликопротеидами 
gр51 
и 
gр30, 
отвечающими 
за 

типоспецифичность. В структуре вириона различают 6 основных белков с 

молекулярной массой от 10 до 51 кДа (р10, р12, р15, р24, gp30 и gp51) (W. 

Uckert et al., 1986). Четыре негликозилированных белка (p10, p12, р15, р24)

составляют 
сердцевину 
вириона, 
причем 
р24 
составляет 
наибольшее  

количество (В.А. Сергеев с соавт., 1983). Два наиболее крупных белка являются

гликопротеидами, один из которых (gр51) расположен на поверхности вириона, 

другой (gр30) является трансмембранным белком (В.Н. Сюрин с соавт., 1986).

Гликопротеиды вируса лейкоза крупного рогатого скота, как и у всех 

ретровирусов, обладают антигенными детерминантами, которые определяют 

индивидуальную специфичность каждого вируса. Белки наружной оболочки 

участвуют в различных взаимодействиях вируса и клетки. С ними связаны 

такие феномены, как круг хозяев, тканевая специфичность, адсорбция вириона 

и его проникновение в клетку, специфичность интерференции, индукция 

синтеза нейтрализующих антител и протективные свойства (В.А.Сергеев с 

соавт., 2007).

ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует 

синтез 
нейтрализующих 
и 
комплементсвязывающих 
антител. 
Он 

агглютинирует 
эритроциты 
мышей. 
За 
инфекционность 
и 

гемагглютинирующую активность ответственен gp51 (M. Tham et al., 1985).

Согласно предложенной ранее номенклатуре, структурные белки вируса 

обозначаются следующим образом: МА – матриксный, СА – капсидный, NC –

белок нуклеокапсида, SU – поверхностный, ТМ – трансмембранный, PR –

протеаза, RT – ревертаза, IN – белок интеграции (J. Leis et al., 1988).

Оболочка вириона образована компонентами клеточной мембраны с 

включенными в них гликопротеидами – gp51 и gp30. По аналогии с другими 

ретровирусами считается, что в капсиде должно быть немного обратной 

транскриптазы и интегразы, но филогенетическое сравнение различных 

ретровирусов показало, что ВЛКРС образует особую группу среди них. Кроме 

того, обратная транскриптаза онкорнавирусов имеет молекулярную массу 80 

кДа и в одном вирионе присутствуют десятки этих молекул. Молекулярная 

масса ревертазы BLV имеет такую же молекулярную массу и, вероятнее всего, 

ее в вирионе BLV нет (Н.З. Хазипов с соавт., 2008).

1.2.2. Геном вируса

Геном вируса может существовать в 2-х формах: геномной 1-цепочечной 

РНК, или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице и 

интегрированной в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК 

содержится только в зрелых вирионах. В зрелом вирионе содержится две 

молекулы РНК. В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 

1 раз, когда служит матрицей для фермента - обратной транскриптазы при 

биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем биохимических процессов, 

необходимый для полной репликации вируса, выполняется с участием ДНК
провируса (В.Н. Сюрин с соавт., 1998).

Геном ВЛКРС, как и у других ретровирусов, представлен 70S РНК, 

состоящей из двух 38S субъединиц (I. Katoh et al., 1991). В дополнение к