Молекулярно-цитогенетический анализ генома птиц
Покупка
Основная коллекция
Издательство:
Год издания: 2004
Кол-во страниц: 277
Дополнительно
Вид издания:
Диссертации и авторефераты
Уровень образования:
ВО - Магистратура
Артикул: 626319.01.99
Акту альность проблемы. Комплексный подход к анализу генома предполагает интеграцию молекулярного и интогенетического уровней исследования хромосом. Изучение молекулярно-цитогенетической организации генома птиц в аспекте сравнения с геномом млекопитающих открывает возможности вскрытия общих закономерностей структурно-функциональной организации хромосомы эукариотической клетки и выяснения ее особенностей, определяемых таксономическим положением видов. Стратегия картирования геномов животных во многом определяется структурой их кариотипов и особенностями организации нуклеиновых кислот.
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И
РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
__________________________________________________________________
на правах рукописи
САЗАНОВ
Алексей Александрович
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ПТИЦ
Специальность 03.00.15 – генетика
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Научный консультант – профессор,
доктор биологических наук Смирнов А.Ф.
Санкт-Петербург - 2004
СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6 ВВЕДЕНИЕ 7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16 1.1. Особенности организации генома птиц 16 1.2. Генетические и физические карты хромосом птиц 30 1.2.1. Генетические карты 30 1.2.2. Физические карты 42 1.2.3. Интеграция генетических и физических карт 51 1.3. Геномные библиотеки как инструмент интеграции молекулярного и цитогенетического уровней изучения генома 55 1.4. Гибридизация ДНК/ДНК in situ как метод прямого физического картирования хромосом 68 1.5. Отношения гомологии (ортологии и паралогии) нуклеотидных последовательностей и хромосомных районов 80 1.5.1. Паралогия 81 1.5.2. Ортология 86 1.6. Композиционная гетерогенность ДНК и функциональная специализация геномных фракций 90 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 105 2.1. Материал 105 2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 106 2.2.1. Подбор последовательностей ДНК и дизайн праймеров 106
2.2.2. Условия амплификации ДНК 108 2.3. Скринирование геномных библиотек 109 2.3.1. Олигонуклетидное мечение ДНК-зондов 109 2.3.2. Гибридизация меченых ДНК-зондов с геномными клонами 110 2.3.3. Верификация аутентичности клонов 110 2.4. Трансформация клеток E. coli и выделение эписомной ДНК 111 2.4.1. Трансформация клеток E. coli 111 2.4.2. Выделение эписомной ДНК макрометодом 112 2.4.3. Очистка эписомной ДНК 113 2.5. Секвенирование фрагментов ДНК 114 2.6. Приготовление препаратов митотических хромосом птиц 116 2.6.1. Приготовление препаратов митотических хромосом из 96 (72)-часовых эмбрионов 116 2.6.2. Приготовление препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов 117 2.7. Флуоресцентная гибридизация ДНК-ДНК in situ (FISH) 119 2.7.1. Мечение ДНК-зондов при помощи ник-трансляции с использованием нерадиоактивных дезоксинуклеотидтрифосфатов 119 2.7.2. Преципитация ДНК-зондов в присутствии конкурирующей ДНК и супрессия неспецифической гибридизации 121 2.7.3. Гибридизация меченых ДНК-зондов с ДНК митотических хромосом птиц 122
2.7.4. Детекция гибридизационных сигналов с использованием флуоресцентных красителей 124 2.7.5. Анализ результатов гибридизации 125 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 127 3. 1. Скринирование гридированных геномных библиотек с использованием кодирующих последовательностей ДНК в качестве зондов 127 3.1.1. Скринирование космидной геномной библиотеки домашней курицы 127 3.1.2. Скринирование геномной BAC-библиотеки джунглевой курицы 129 3. 2. Прямое физическое картирование маркеров первого типа на митотических хромосомах домашней курицы 135 3.2.1.Семейство генов циклинов 135 3.2.2. Семейство генов авидинов 139 3.2.3. Семейство генов аденозиновых рецепторов 141 3.2.4. Гены MC1R и BBC1 141 3.2.5. Гены APOA1 и ETS1 145 3.2.6. Гены ALB, ANX5, EDNRA, GDF8, MGF, MGP и TYR 145 3.3. Композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела 155 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 188
4.1. Оценка эффективности применения гридированных геномных библиотек для молекулярно-цитогенетического анализа генома птиц 188 4. 2. Клонирование и хромосомная локализация кластера генов семейства авидинов 193 4. 3. Эволюционный консерватизм районов хромосом домашней курицы и человека 199 4.3.1. Консерватизм теломерной локализации генов MC1R и BBC1 199 4.3.2. Колокализация генов APOA1 и ETS1на одной микрохромосоме 203 4.3.3. Ортология GGA 1p21-q12 и HSA 12p13-q23 206 4.3.4. Ортология GGA 1q23-q44 и HSA 11p15-q22 212 4.3.5. Ортология GGA 3q23-q210 и HSA 6p12-q27 215 4.3.6. Ортология GGA 4q11-q24 и HSA 4p16-q28 217 4.3.7. Ортология GGA 5q11-q12 и HSA 11p13-q24 222 4. 4. Отношения паралогии нуклеотидных последовательностей внутри семейства генов аденозиновых рецепторов домашней курицы 225 4.5. Сравнительное композиционное картирование хромосом домашней курицы и японского перепела. Функциональная компартментализация генома птиц 228 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 233 ВЫВОДЫ 236 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 238
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ADORA1 – аденозиновый рецептор А1 ADORA2B – аденозиновый рецептор А2Б ADORA3 – аденозиновый рецептор А3Б ALB - альбумин ANX5 – аннексин 5 APOA1 – аполипопротеин А1 BBC1 – основной белок 1 карциномы молочной железы CCNC - циклин C CCND1 – циклин D1 CCND2 – циклин D2 CCND2P – циклин D2 (псевдоген) CCNE – циклин E EDNRA – эндотелиновый рецептор А-типа GDF8 – фактор 8 роста и дифференцировки клеток (миостатин) GGA – хромосомы (районы хромосом) домашней курицы HSA – хромосомы (районы хромосом) человека MC1R – рецептор 1 меланокортина MGF – ростовой фактор клеток молочной железы MGP – Gla-белок ядерного матрикса QTL – локус, контролирующий количественный признак TYR - тирозиназа
ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Комплексный подход к анализу генома предполагает интеграцию молекулярного и цитогенетического уровней исследования хромосом. Изучение молекулярно-цитогенетической организации генома птиц в аспекте сравнения с геномом млекопитающих открывает возможности вскрытия общих закономерностей структурно функциональной организации хромосомы эукариотической клетки и выяснения ее особенностей, определяемых таксономическим положением видов. Стратегия картирования геномов животных во многом определяется структурой их кариотипов и особенностями организации нуклеиновых кислот. Среди позвоночных животных класс Aves отличается наибольшей консервативностью величины геномов: для изученных в этом отношении видов птиц содержание ДНК на клеточное ядро варьирует от 1.7 до 3.5 пг. Гаплоидный геном птиц в среднем состоит из 1.2 x 109 пар нуклеотидов, что в 2.75 раза меньше, чем у млекопитающих (Kadi et al., 1993). Сравнительно низкое содержание ДНК в геномах птиц объясняют “необходимостью полета”, а высокий эволюционный консерватизм этого показателя – монофилетическим происхождением класса Aves (Kadi et al., 1993). Главной отличительной особенностью кариотипов птиц является многочисленность и гетерогенность входящих в их состав хромосом. Ввиду того, что хромосомы в классе Aves различаются по размеру, их принято условно делить на 2
группы: группу макрохромосом, состоящую из шести – восьми пар относительно крупных по размеру (3 - 8 мкм) хромосом и группу микрохромосом – мелких трудноидентифицируемых хромосом (0.3 - 3 мкм) (Schmid et al., 2000). Несмотря на то, что представитель класса Aves – домашняя курица – стала первым объектом генетики животных (Bateson and Sounders, 1902), ограниченное число молекулярно-цитогенетических работ на момент начала исследований в рамках представленной работы (1990) было проведено на небольшом числе видов птиц. Генетические и физические карты хромосом птиц, являющиеся своего рода путеводителем по геному, остаются сравнительно малонасыщенными и по настоящее время (www.thearkdb.org). Наиболее изученным с генетической точки зрения видом птиц является домашняя курица Gallus gallus, что обусловлено как хозяйственным значением этого вида, так и удобством ее использования в качестве модельного лабораторного объекта. Способность к размножению круглый год и сравнительно быстрая смена поколений существенно упрощает эксперименты по гибридологическому анализу. Детальная информация по биологии развития этого вида позволяет обсуждать генетические данные в общебиологическом контексте. Своеобразие организации кариотипов птиц – структурная компартментализация генома (наличие микро- и макрохромосом) – давно привлекает внимание цитогенетиков в отношении изучения возможной функциональной специализации хромосом. В последнее время показана
высокая генетическая активность микрохромосом, плотная насыщенность их кодирующими последовательностями ДНК, в первую очередь генами «домашнего хозяйства» и онкогенами (McQueen et al., 1998). Прямое физическое картирование хромосом курицы проводится преимущественно методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В настоящее время известна внутрихромосомная локализация около 250 маркеров первого типа (кодирующих генов), кроме того, многие физически картированные протяженные (30 – 200 т.п.н.) геномные клоны могут содержать кодирующие последовательности (www.thearkdb.org). Применяются различные варианты ДНК-ДНК гибридизации in situ и системы детекции гибридизационного сигнала. В качестве ДНК-зондов часто используются протяженные (30 – 200 т.п.н.) клоны из геномных гридированных библиотек, что на наш взгляд, является наиболее перспективным подходом, поскольку позволяет добиться почти стопроцентной эффективности гибридизации (Buitkamp et al., 1998; Smith et al., 2001; Sazanov et al., 2002). Большие надежды возлагают на использование специальных хромосомоспецифических проб для микрохромосом и пэйнтинговых ДНК-зондов для макрохромосом (Zimmer et al., 1997; Fillon et al., 1998; Guillier-Gensik et al., 1999), которые могут существенно упростить процедуру идентификации хромосом и хромосомных районов. Нужно отметить, что использование хромосом типа ламповых щеток параллельно с митотическими зачастую позволяет повысить разрешающую способность метода (Mizuno et al., 1998; Rodionov et al., 2002).
В настоящее время известно более ста ортологичных районов курицы и человека (Schmid et al., 2000; Burt, 2002). С точки зрения сравнительного картирования, ортологии хромосомных районов, домашняя курица оказалась более близкой к человеку, чем даже домовая мышь (Burt et al., 1999). Это, с одной стороны, позволяет экстраполировать данные полного секвенирования генома человека на значительное число хромосомных районов птиц, с другой стороны определяет ценность данных геномики курицы для генетики человека и медицинской генетики. Высокий уровень эволюционного консерватизма кариотипа птиц и показанная в последнее время высокая гомология нуклеотидных последовательностей (Родионов, 2002) дают основание говорить об этом классе как едином целом в отношении молекулярной организации генома. Основными направлениями структурно-функциональной характеристики геномов являются: - построение генетических и физических карт хромосом - исследование блочной организации и композиционное картирование хромосом - выявление внутригеномной гомологии (паралогии) и гомологии нуклеотидных последовательностей у разных видов (ортологии). Цели и задачи исследования. Целью данной работы является комплексная характеристика молекулярной организации генома птиц. Сформулированы следующие задачи:
- оценка эффективности применения гридированных геномных библиотек высокой плотности как инструмента геномного картирования - локализация на хромосомах маркеров первого типа (кодирующих последовательностей ДНК) - «заякоривание» маркеров первого типа на сравнительных генетических и физических картах хромосом человека и выявление ортологии хромосомных районов - анализ распределения по геному генов различных семейств - исследование паралогии на примере семейства генов аденозиновых рецепторов - композиционное картирование хромосом курицы и перепела - характеристика функциональной специализации микро- и макрохромосом. Научная новизна работы. Впервые продемонстрирована эффективность использования гридированных геномных библиотек для комплексных исследований генома птиц. Впервые клонирован кластер генов семейства авидинов домашней курицы. Впервые установлена локализация генов ADORA1, ADORA2B, ADORA3, APOA1, AVD, AVR, BBC1, CCNC, CCND1, CCND2, CCND2P, CCNE, EDNRA, GDF8, MC1R на хромосомах домашней курицы. С использованием протяженных ДНК-зондов подтверждена ранее установленная другими авторами локализация генов ALB, ANX5, MGF, MGP и TYR. Впервые использован метод двуцветной флуоресцентной гибридизации in situ для колокализации нуклеотидных последовательностей на микрохромосомах. Впервые установлена ортология макрохромосом 3 и 5
домашней курицы и хромосом 6 и 11 человека, соответственно. Впервые показан эволюционный консерватизм теломерной локализации генов BBC1 и MC1R у птиц и млекопитающих. Впервые исследован на хромосомном уровне феномен паралогии в геноме птиц на примере семейства генов аденозиновых рецепторов. Впервые проведено композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела и продемонстрирована структурно-функциональная компартментализация генома птиц. Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим и физическим картам хромосом курицы и сравнительным картам человека, мыши и курицы (www.thearkdb.org) и банка данных нуклеотидных последовательностей (www.nlm.ncbi.nih.gov) в сети Интернет (более 500 идентификационных входов). Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университете в рамках магистерской программы «Эволюционная цитогенетика». Поскольку домашняя курица и японский перепел являются ценными сельскохозяйственными видами, данные по картированию нуклеотидных последовательностей на хромосомах этих видов могут быть использованы в работах по позиционному клонированию хозяйственно ценных признаков и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker-assisted selection). Данные по эволюционному
консерватизму районов хромосом человека и домашней курицы могут быть использованы для моделирования хромосомных болезней человека. Апробация работы. Материалы работы были представлены на VI съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Н.И.Вавилова (Минск, 1992), I-ой международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994), I-ом съезде Российского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Саратов, 1995), международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2001), II-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), а также за рубежом на XVII-ом Международном съезде генетиков (Бирмингем, Великобритания, 1993), XI-ой Европейской Птицеводческой конференции (Айр, Великобритания, 1994), XI-ом Североамериканском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию домашних животных (Техас, США, 1995), VI-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 1998), XV-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию животных (Неаполь, Италия, 2002), X-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2002). Результаты периодически докладывались на отчетных сессиях ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН, семинарах кафедры генетики и селекции СПбГУ,
кафедры селекции животных Мюнхенского технического университета и на рабочих совещаниях программы Европейского Союза “Chickmap”. Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации были опубликованы в научных журналах “Nature”, “Animal Genetics”, “Chromosome Research”, “Cytogenetics and Cell Genetics”, «Генетика» и «Цитология». Всего по теме работы опубликована 41 печатная работа. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц, 46 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Литература». Положения, выносимые на защиту. Гридированные геномные библиотеки ДНК птиц могут быть эффективно использованы для комплексного анализа генома на молекулярном и хромосомном уровнях. Авидиновые гены домашней курицы организованы в форме кластера, который находится в районе Zq21. Гены ALB, ANX5, APOA1, BBC1, CCNC, CCND1, CCND2, CCND2P, CCNE, EDNRA, GDF8, MC1R, MGF, MGP и TYR проявляют эволюционный консерватизм локализации на хромосомах человека и домашней курицы, что свидетельствует о высоком уровне гомологии хромосом этих видов.