Диагностика вирозов

Министерство сельского хозяйства РФ

Департамент кадровой политики и образования

Новосибирский государственный аграрный университет

В.Н. Грязин, В.Н. Кисленко

ДИАГНОСТИКА

ВИРОЗОВ

Учебное пособие

2-е издание, стереотипное

Допущено

Министерством сельского хозяйства

в качестве учебного пособия

Москва

Инфра-М; Znanium.com

2016

УДК 619:616.98:578-078
ББК 48

Рецензенты:
заслуженный деятель науки, доктор ветеринарных наук, профессор Смирнов П.Н.;
доктор ветеринарных наук, профессор Шкиль Н.А.;
заведующий кафедрой микробиологии, доктор ветеринарных наук, профессор 
Бурлаков В.А.

Грязин В.Н., Кисленко В.Н.
Диагностика вирозов: учебное пособие. – 2-е изд., стереотип. – М.: Инфра-М; 
Znanium.com, 2016. – 140 с.

ISBN 978-5-16-104811-5 (online)

В пособии подчеркнута особая роль вирусного компонента в паразитоценозе смешанных инфекций, дана характеристика классических и современных методов 
культивирования вирусов и диагностики вирусных болезней. Особое место отведено методам культивирования клеток методам органного культивирования тканей. Приведен комплекс ситуационных задач по программе клинической вирусологии.
Учебное пособие предназначено для студентов очного и заочного форм обучения, 
ветеринарных специалистов, ФПК и преподавателей.

УДК 619:616.98:578-078

ББК 48

ISBN 978-5-16-104811-5 (online)
© Грязин В.Н., Кисленко В.Н., 2005, 2016

СОДЕРЖАНИЕ

Введение......................................................................................................... 5

Методы идентификации вирусов................................................................8

Методы прямого обнаружения вирусов в исследуемом

материале......................................................................................... 10

Обнаружение вирусоспецифического антигена в исследуемом 

материале методом 
люминесцентной 
(флуоресцентной)

микроскопии.................................................................................... 14

Метод иммуноферментного анализа...........................................21

Электронная микроскопия на наличие вирионов......................24

Полимеразная цепная реакция.......................................................30

Методы обнаружения (выделения) вирусов в патологическом

материале от больных животных и трупов............................................... 33

Культивирование 
вирусов 
в 
развивающихся 
куриных

эмбрионах.......................................................................................47

Методы титрования вирусов........................................................57

Общие принципы диагностики вирусных болезней.....................61

Принципы постановки отдельных серологических

реакции..........................................................................................  
 
67

Культивирование вирусов в клеточных ку льтурах................... 78

Ситуационные задачи................................................................121

Литература..................................................................................................137

4

ВВЕДЕНИЕ

Все большую значимость в настоящее время приобретает 
проблема дальнейшего развития и выживаемости человека и 
человечества 
в 
целом 
в 
условиях 
угрозы 
экологического 
демографического, 
энергетического 
кризисов 
глобального 
масштаба. 
Предпосылкой 
для 
этого 
является 
нарушение 
экологического равновесия, которое принимает в современном 
мире все более значительные размеры. В не столь отдаленном 
прошлом 
промышленное 
освоение 
богатых 
природными 
ресурсами районов происходило 
постепенно, 
не одним 
поколением. Сдвиг равновесия в экосистеме был медленным, не 
обращал на себя особого внимания. Сейчас происходит бурное, 
интенсивное, с использованием могучей техники, привлечением 
огромных 
материальных и 
людских 
ресурсов 
освоение 
природных богатств, причем очень часто без учета последствий, 
особенно в районах Сибири. Промышленными отходами и 
ядохимикатами 
загрязняется 
окружающая среда, 
нарушается 
структура исторически сложившихся сообществ в животном 
мире, изменяется соотношение сельского и городского населения, 
увеличивается поголовье и концентрация сельскохозяйственных 
животных и др. Все это приводит к чрезвычайно быстрому 
преобразованию 
компонентов 
биосферы, 
способствует 
формированию 
различных 
по 
патогенности 
и 
составу 
паразитоценозов и в конечном итоге ведет к ослаблению 
резистентности организма животных, массовым заболеваниям, 
значительному недополучению продукции животноводства.

Одним из основных компонентов, чутко реагирующим и в 
значительной мере влияющим на возникновение массовых заболеваний, 
является вирусный компонент.
В последнее время широко обсуждается роль виру сов в переносе генетической 
информации в биосфере. Рассматривается и противоположная сторона явления 
- значение этих процессов дтя эволюции са\шх вирусов, которая всегда 
сопряжена с эволюцией хозяев.

У вирусов может вырабатываться устойчивость к противовирусным 
средствам, разработка которых ведется во всем мире главным образом за 
счет размножения устойчивых му тантов, прежде не имевших селективной 
ценности. В результате действия на вирусы химических и других 
неблагоприятных факторов значительно увеличивается фон спонтанных 
му таций, т.е. интенсивно происходят процессы микроэволюции. Поэтому 
изменение среды обитания благоприятству ет эволюции су ществу ющих 
видов, которая может происходить в неблагоприятном для животных и 
человека направлении. Ее результатом может стать появление новых 
вариантов возбудителя с более высокой патогенностью и вирулентностью. 
В этом случае борьба с вирусами ввиду их эволюционной пластичности 
затру днена. Живые вакцины являются эффективным, но не универсальным 
средством борьбы с вирусными болезнями. Приходится считаться с 
опасностью реверсии вакцинного штамма и опасностью того, что организм 
животного полностью не освободится от вируса, и может возникнуть 
хроническая инфекция.

Путь к эпизоотической стабильности в попу ляциях сельскохозяйственных животных в общих чертах известен. Для этого необходимо 
использование в производстве приспособленных к местным у словиям и 
генетически устойчивых к инфекциям животных; комплектование стад с 
учетом 
однородности иммунологического статуса; 
использование 
оптимальных безотходных технологий, при которых должен соблюдаться 
принцип "технология для животных, а не животные для технологии". Таким 
образом, нужно не допускать перестройки сложившегося равновесия 
между микро - и макроорганизмом, вытеснения одних клонов другими.

Борьба с заболеваниями животных, особенно с болезнями молодняка, 
представляет огромные трудности вследствие их полиэтиологичности, 
отсутствия, а иногда и бесполезности использования биологических 
препаратов, особенно крупных хозяйств, специализирующихся на 
производстве говядины и выращивании племенных животных, занимают 
острые респираторные заболевания. Особенно большой ущерб они наносят 
хозяйствам, стадо которых комагектуется из так называемого "сборного" 
поголовья. Значительный ущерб может складываться и из недополучения 
значительной доли продукции вследствие поставки мясокомбинатам так

б

называемых животных-заморышей. лшпения возможности вырастигь 
высокомолочных племенных животных.

Природа острых респираторных заболеваний (ОРЗ) весьма 
сложная. 
С 
одной 
стороны, 
эти 
заболевания, 
безусловно, 
инфекционные, а с другой - на их возникновение, течение и исход 
оказывают влияние внешние неблагоприятные факторы. Из них 
наиболее 
значительными 
являются 
факторы, 
связанные 
с 
нарушением сложившегося равновесия микро - и макроорганизмов в 
популяции.

Коварство вирусных инфекций заключается в том, что они, 
разрушая слизистые барьеры, "открывают ворота" для патогенной и 
условно-патогенной микрофлоры, 
которая разрушает жизненно 
важные системы организма.

По 
своему 
составу 
паразитоценоз, 
включающий 
весь 
"ассортимент" микроорганизмов, не только разнообразен, но и 
подвижен, так как он может меняться у здорового и больного 
животного в зависимости от возраста, режима питания и других 
факторов.

Синергизм в смешанных инфекциях -  явление широко 
распространенное и сравнительно давно известное. В естественных 
у словиях в организме не только микробы и вирусы, но и гельминты, и 
простейшие 
находятся 
в 
сложных 
и 
многообразных 
взаимоотношениях. Это часто обусловливает неадекватность клиникоморфологических изменений при экспериментально и естественно 
протекающих 
инфекциях. 
Хорошо 
известна 
трудность 
воспроизведения так называемой "транспортной лихорадки" крупного 
рогатого скота одним вирусом парагриппа-3 без участия пастерелты 
му льтоциды. 
Кстати сказать, 
что во время вспышки острых 
респираторных заболеваний кру пного рогатого скота в некоторых 
хозяйствах удавалось изолировать одновременно сразу несколько 
виру сов 
(и , 
одновременно 
обнаружить 
положительную 
сероконверсию). Чаще всего это вирус парагриппа-З и аденовирус 
крупного рогатого скота 
1 
серогрупп. А также очень часто 
присутствие пастерелты рода НаепюНйса.

В 
паразитоценозс 
проявляется 
не 
только 
синергизм, 
что 
в 
методическом отношении легче обнаруживается и у дачно воспроизводится, 
но и антагонизм, который также представляет большой практический 
интерес.

Таким образом, учитывая огромную значимость вирусного 
компонента в патологии кру иного рогатого скота и дру гих видов животных, 
сложность этого компонента, а также влияние на течение и исход 
заболевания других микроорганизмов и факторов, для правильной 
профилактики и квалифицированного подхода к оздоровлению стад 
необходимо широко использовать различные диагностические приемы.

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ

Когда из материала от больного животного выделен вирус, сразу же 
возникает необходимость его идентифицировать (т.е. установить, какой 
именно виру с у далось выявить).

Грубо ориентировочно определить, какой выделен (изолирован) 
вирус, можно уже по тому, от какого вида животного получен 
патологоанатомический материал, так как у каждого вида животных свой 
"набор" возможных вирусов. Вторым ориентировочным моментом может 
служить вид лабораторной системы, на которой выделен вирус, так как 
каждый вид лабораторных животных, вид культуры клеток, куриные 
эмбрионы и другие чувствительны только к определенным вирусам. Если 
вирус выделен на культуре клеток, можно испытать зараженную культуру 
клеток на способность к гемадсорбции с эритроцитами разных животных (и 
даже эритроцитами человека). Наличие гемадсорбирутощих свойств также 
может 
быть 
ориентиром 
в 
идентификации 
вируса. 
Важным 
ориентировочным моментом является наличие у выделенного вируса 
гемагг.лютинирутощих свойств.

Но 
наиболее 
точная 
идентификация 
неизвестного 
вируса 
достигается с помощью серологических тестов. Для серологической 
идентификации необходимо выделенный виру с использовать как антиген и

8

с ним поставить несколько серологических реакций, 
используя в 
каждой сыворотки, имеющие специфические антитела к заведомо 
известным. Та сыворотка, с которой выделенный вирус будет 
работать в серологической реакций, и укажет, какой это вирус. Важно 
только рационально выбрать серологическую реакцию.

Если вирус выделяли на культуре клеток, и он давал 
гемадсорбцию, то проще и быстрее всего идентифицировать вирус в 
реакции торможения гемадсорбщш. Правда, таких виру сов известно 
не так много. Так, вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота дает 
гемадсорбцию в ку льтуре клеток почки теленка с эритроцитами 
морской свинки и может быть идентифицирован в РГАд с теми же 
эритроцитами и специфической сывороткой к ПГ-3.

Если 
вирус 
обладает 
гемадсорбиру ющей 
активностью, 
наиболее целесообразно для его идентификации использовать 
реакцию торможения гемагглютинации. 
Если выделенный 
вирус не обладает гемагтлютинирующей активностью, имеет 
смысл воспользоваться реакцией диффузионной преципитации в 
агаровом геле, но только при условии, что и антиген и сыворотки 
будут в достаточно высоких тиграх (так как РДП обладает невысокой 
чу вствительностью) и обязательно с постановкой положительных и 
отрицательных контролей.

В случае, если РТГАд. РГГА, РДП воспользоваться не 
представляется возможным, 
следует провести идентификацию 
выделенного 
вируса 
в 
реакции 
связывания 
комплемента, 
использовав 
модификацию 
с 
разведениями сывороток и с 
несколькими (разными) дозами комплемента. При этом, если 
требуется определение типа или штамма вируса. РСК надо ставить 
"горячим" методом, а в других случаях предпочтительнее вести 
этап связывания комплемента длительно на холоду (18-20 часов 
при 2...4°С).

Наиболее у ниверсальной и специфичной является реакция 
нейтрализации, она дает наиболее достоверные резу льтаты.

Реакции имму нофлу оресценции и непрямой гемагглютинации с

все более расширяющимся выпу ском биофабричных диагности 
9

кумов приобретают все большее значение как экспресс-методики, и они 
могут 
быть 
использованы 
как 
разведочные 
с 
последующим 
подтверждением другими, приемлемыми для данной ситуации тестами. 
Для группы вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота 
реакции иммунофлуорссценции и непрямой гемагглютинации вполне 
приемлемы и полупили положительные отзывы специалистов.

МЕТОДЫ ПРЯМОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ В 
ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ

Исследование мазков отпечатков из патматериапа и гистосрезов в 
световом микроскопе.

Практически при многих вирусных инфекциях в клетке (в 
цитоплазме или в ядре) можно обнаружить не свойственные нормальной 
клетке образования, которые специалисты -  морфологи называют 
«включения». При более детальном исследовании в электронном 
микроскопе это не что иное, как скопление вирусных частиц в 
сформированном виде или белковые компоненты вирионов. По традиции 
эти скопления называют «тельца включения». При разных вирусных 
инфекциях тельца - включения по форме, размерам, способности 
воспринимать красители (базофильные или ацидофильные), стадии 
развития болезни могут быть различны.

Выявление элементарных телец - включений с помощью 
иммерсионной системы светового микроскопа в ряде случаев дает 
основание предполагать природу возбудителя. Так при бешенстве, 
значительная часть «диких» штаммов образует в клетках аммоновых 
рогов, продолговатого мозга слюнных желез специфические тельца - 
включения Бабеша - Негри. Тельца - включения изучены также при 
оспе, 
чуме 
плотоядных, 
ларинготрахеите 
птиц. 
В 
световом 
микроскопе при специальных методах окраски удается наблюдать 
некоторые вирусы "гиганты" (оспы, эктимы) и риккетсии.

В случаях. если размер частиц превышает половин) длины 
световой волны обычного видимого света (увеличение микроскопа 
в 1350 раз - объектив 90, окуляр 15).

Для световой микроскопии из патологического материала, 
соскобов со слизистых оболочек готовят мазки - отпечатки иногда 
гистологические срезы из тканей органов. Можно использовать 
инфицированные вирусом клеточные культуры, полученные в виде 
монослоя на покровных стеклах. Мазки - отпечатки высушивают на 
воздухе и фиксируют в метиловом спирте, спирт - эфире ити 
химически чистым охлажденным ацетоном.

Для окраски элементарных телец предложено несколько 
методов: 
Пашена, 
Герберта. 
Морозова. 
Муромцева. 
Михина, 
Селлерса, Манна. Наиболее удобным и общедоступным (при 
наличии кристаллического азотнокислого серебра) является метод 
М.А. Морозова (при диагностике оспы).

Окраска по Морозову
После высушивание на воздухе мазки помещают на 2 - 3 мин в 
дистиллированную воду, после этого покрывают жидкостью Руге 
(реактив №1), через 1 мин жидкость сливают, препарат 
промывают дистиллированной водой и протравливают реактивом 
№2 при подогревании до появления паров (1 - 1,5 мин). После 
ополаскивания водой мазок обрабатывают в течение 1 — 2 мин 
реактивом №3 при легком подогревании, пока препарат не приобретет 
темно - коричневую окраску. Затем его тщательно промывают 
дистиллированной водой и высушивают на воздухе или с помощью 
фильтровальной бумаги.

Приготовление реактивов.
Реактив №1 (жидкость Руге): 1 мл ледяной уксусной 
кислоты, 2 мл 40% - ного формальдегида и 100 мл дистиллированной 
воды.

Реактив №2: 5 г танина. 100 мл дистиллированной воды и 
1 мл жидкой карболовой кислоты.

Реактив 
№3 
(раствор 
аммиачного 
серебра): 
5 
г

кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дис 
11