МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ РОССИИ
ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МПР ПО МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ
ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ДОМ «ФИНАНСОВЫЙ КОНТРОЛЬ» МЕЖДУНАРОДНЫЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР МГУ им. М. В. ЛОМОНОСОВА
КООРДИНАЦИОННЫЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ СОВЕТ МГУ
КООРДИНАЦИОННЫЙ СОВЕТ МГУ «НАУКИ О ЖИЗНИ» БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ МГУ
ИНСТИТУТ УСТОЙЧИВЫХ СООБЩЕСТВ (Проект «Экологическая токсикология: подготовка специалистов-биотехнологов для решения проблем окружающей среды»




                НЕФТЯНЫЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ: КОНТРОЛЬ И РЕАБИЛИТАЦИЯ ЭКОСИСТЕМ
                (УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ)




        ПОД РЕДАКЦИЕЙ
        доктора биологических наук С.В.КОТЕЛЕВЦЕВА, профессора А.П.САДЧИКОВА


            (к 250-летию Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова)


        Москва
        2003

ББК 28.080.1
   Н76

      Рецензенты:
      профессор Воронежского государственного университета
      В.Г.Артюхов
      профессор Российского университета дружбы народов, академик
      РАЕН Ю.П.Козлов
      профессор Московского государственного университета им.
      М.В.Ломоносова, член-корреспондент РАН Е.А.Криксунов





                Н76 Нефтяные загрязнения: контроль и реабилитация экосистем: Учебно- методическое пособие.




            Под редакцией доктора биологических наук С.В.Котелевцева,профессора А.П.Садчикова. -М.: Изд-во ФИАН, 2003. - 194 с.




Отпечатано с готового оригинал-макета Редакционно-издательская и информационная служба Физического института им. П.Н.Лебедева РАН Подписано к печати 19.06.2003 г.
Форма 60x84/8. Усл. печ. л. 22,5. Заказ №
Тираж 300 экз.
Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 132-51-28
                        © Международный биотехнологический центр
                                     МГУ им. М.В.Ломоносова, 2003
                                         © Коллектив авторов, 2003

    ВВЕДЕНИЕ




       Развитие промышленности и сельского хозяйства, добыча и транспортировка полезных ископаемых, а также последствия военной деятельности государств, несмотря на систему мер по охране окружающей среды, приводят к все возрастающему поступлению в экосистемы различных токсикантов. Среди множества зарязнителей экосистем необходимо выделить нефть и нефтепродукты, поступление которых в окружающую среду постоянно возрастает и оказывает токсическое действие на все звенья пищевой цепи.
       Нефтяное загрязнение является повсеместным, и действие других токсикантов может проявляться на фоне нефтяного загрязнения среды.
       По самым скромным подсчетам поступление нефти в различные экосистемы достигает 10 млн. тонн в год. Выявление глобального характера загрязнения наземных и водных экосистем нефтью и нефтепродуктами на первый план выдвигает вопросы глубокого изучения их функционирования и разрушения в экосистеме с соответствующими расчетами.
       Попавшая в воду нефть проникает в толщу воды, накапливается в донных осадках и, таким образом, воздействует на все группы организмов: нейстон, плейстон, планктон, нектон и бентос.
       Покрывая поверхность воды, нефть препятствует движению, дыханию и питанию мелких животных. Нефтяные пленки, в первую очередь, оказывают губительное воздействие на нейстонные организмы, включающие преимущественно гидробионтов, находящихся на ранних стадиях онтогенеза.
       Попадая в живые организмы углеводороды нефти разрушают клеточные мембраны и легко проникают через липопротеидные клеточные барьеры, приводя к метаболическим и морфологическим нарушениям. Большие молекулы полициклических ароматических углеводородов нефти поникают клетку и встраиваются в липиды клеточных мембран, что приводит к гибели клетки, кроме того, ряд нефтепродуктов обладает мутагенным и канцерогенным эффектом.
       Для сохранение биоразнообразия как в водных, так и наземных экосистемах необходимы не только охранные мероприятия, позволяющие сохранять и воспроизводить отдельные виды животных и растений, исчезающих в результате расширяющегося их сбора и вылова, с дальнейшем использованием в пищу или в виде промышленного сырья, но и предотвращать (или по крайней мере ограничивать)

1

поступление в окружающую среду ксенобиотиков, накопление которых со временем способно модифицировать экосистемы.
        При биомониторинге экосистем индивидуальный анализ химических компонентов в окружающей среде и особенно в тканях животных и растений необходим, однако не всегда возможен, так как, во-первых, часто неизвестен даже класс химических соединений, которые нужно контролировать, а, во-вторых, действующие концентрации некоторых ксенобиотиков порой столь малы, что для химико-аналитического контроля не всегда достаточно даже специальных высокочувствительных и дорогостоящих методов (таких, например как хроматомасс-спектрометрия).
        Многие биологически активные вещества, в том числе и содержащиеся в нефти и нефтепродуктах, нестабильны и после взаимодействия с биологической мишенью в короткие сроки распадаются, что затрудняет их химический анализ. Таким образом, желательно не только знать какие загрязнители и по каким механизмам аккумулируются в компонентах окружающей среды, но изучать и прогнозировать отклик экосистем на антропогенные воздействия.
        Все это говорит о том, что решение проблем охраны окружающей среды в настоящее время невозможно без использования современных биологических тест систем и биотехнологий.
        Стремительное развитие молекулярной биологии, генетики, микробиологии, энзимологии, биофизики заложили основу для практического использования фундаментальных достижений этих наук в решении практических природоохранных задач. Современные биотехнологии широко используются при реабилитации загрязненных территорий (в первую очередь нефтепродуктами), для контроля изменений различных параметров среды, для осуществления биомониторинга, очистки и контроля качества воды, почвы и т.п.
        При поддержке Министерства природных ресурсов России Биотехнологический центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова с участием Координационного экологического совета МГУ и Координационного совета МГУ «Науки о жизни» провел конференцию «Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды» (см. Доклады конференции «Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды». Изд-во ФИАН им. П.Н.Лебедева, 2003 г.). Одним из решений этой конференции было издание учебно-методического пособия, освещающего современные проблемы мониторинга и реабилитации экосистем от нефтяных загрязнений. Мы рекомендуем вниманию читателей это пособие, в которое вошли обзорные статьи специалистов, принимавших участие в работе конференции. В пособии не только обобщен теоретический и практический опыт авторов по мониторингу и реабилитации экосистем от нефтяных загрязнений, но и использованы материалы, доложенные различными специалистами на этой конференции.
        Мы надеемся, что данное пособие будет полезно различным специалистам, занимающимся решением проблем охраны и реабилитации экосистем, студентам и

2

аспирантам вузов, изучающих экологию и биотехнологию, рациональное природопользование.
       Биотехнологический и Экологический центры МГУ, при поддержке Координационного и экологического совета и совета «Науки о жизни» МГУ планирует сделать конференцию «Биотехноллогия в охране и реабилитации окружающей среды» регулярной и регулярно издавать учебные и методические пособия по этой теме. Мы считаем необходимым объединение усилий различных специалистов для подготовки кадров, не только обладающих теоретическими знаниями, но и способных решать практические задачи охраны и реабилитации экосистем с помощью передовых методов современной науки.


       С.В. Котелевцев, Е.А. Криксунов, А.П. Садчиков, А.В. Смуров.

3

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ: ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
В.В. Ильинский

    1. ВВЕДЕНИЕ

     Нефть и нефтепродукты, попадающие в водоемы в результате хозяйственной деятельности человека, продолжают оставаться в числе наиболее распространенных загрязнителей водных экосистем и, более того, ныне превратилась в постоянно действующий экологический фактор. Если поступление нефти из антропогенных источников в Мировой океан в последние годы несколько снизилось, главным образом из-за ужесточения требований к танкерным перевозкам, то в большинстве акваторий России картина иная. За последние 25 лет накопленные потери нефти и основных нефтепродуктов составили по России 200 млн. тонн. Как следствие, удельное нефтяное загрязнение на 1 км² в отдельных регионах достигает 16 тыс. тонн. В первую очередь от этого страдают внутренние водоемы и грунтовые воды, наиболее подверженные влиянию поверхностных стоков с нефтезагрязненных территорий. Нефть и нефтепродукты, попадающие в водоемы в результате хозяйственной деятельности человека, превратились в целом ряде регионов России в постоянно действующий экологический фактор (Егоров, Шипулин, 1998). Эта проблема приобрела на современном этапе развития цивилизации особую остроту в связи с возрастающим дефицитом питьевой воды.

    1.1. Источники углеводородов в водной среде.

     В.И.Вернадский отмечал, что нефтяные углеводороды (УВ) являются частью глобальной системы круговорота углерода в земной коре. Согласно оценкам экспертов, основными формами УВ в морской среде, исходя из их генезиса, являются: УВ, синтезированные морскими организмами, сырая нефть и нефтепродукты, поступающие в результате антропогенного загрязнения морской среды и просачивания из толщи осадков, а также продукты неполного сгорания топлива (Немировская, 2000).
     К основным источникам синтезируемых УВ относятся все растения, животные и микроорганизмы суши и океана. Благодаря специфике современного биосинтеза, происходит в основном образование алифатических УВ. По вопросу биосинтеза полициклических ароматических УВ единого мнения нет, а их концентрации в природных объектах в среднем в тысячу раз ниже, чем алифатических УВ.
     Состав УВ различается в зависимости от источников их поступления: алканы фитопланктона и фитобентоса характеризуются преобладанием н-С₎₇, н-С]₅ и н-С₁₉, cis-3,6,9,12,15,18-генейкозанексана, гопана, а среди изо-соединений - пристана и фитана; микробиальные - доминированием н-С|₆ и н-С₂₀-С₂5, при этом отношение нечетных алканов к четным (индекс CPI) =1; терригенные - доминированием высокомолекулярных нечетных гомологов (СР1>1). В составе незамещенных биогенных ПАУ преобладают фенантрен, хризен. Считается, что живое вещество Земли генерирует ежегодно 100 млн.

4

т УВ. В Мировом океане путем фотосинтеза продуцируется от 3 до 12 млн. т УВ в год (Миронов, 1985). Последняя цифра более вероятна (Немировская, 2000).
    Нефтяные УВ доминируют среди остальных компонентов нефтей, их доля варьирует от 50 до 98%. В составе этих соединений преобладают алканы, нафтеновые и ароматические соединения, некоторые из них близки современным биосинтезированным УВ. Общее поступление нефтяных УВ в морскую среду оценивается от 1,7 до 8,6 млн. т в год. В последние годы имеется тенденция к уменьшению поступления нефти в Мировой океан из антропогенных источников - с 6,1 до 2,35 млн. т в год - за счет снижения сбросов промывочных и балластных вод (Немировская, 2000). Объем ежегодного поступления антропогенных УВ во многом зависит от количества аварийных разливов, хотя на их долю приходится в среднем всего около 6% от общего поступления этих поллютантов.
       Из приведенных цифр становится ясно, что синтез УВ морскими организмами несколько превышает суммарный объем их ежегодного поступления в Мировой океан за счет антропогенной деятельности. При этом наблюдаются не только количественные, но и качественные различия УВ, поступающих из этих источников. Кроме того, биосинтез УВ происходит достаточно медленно и скорость их образования соизмерима со скоростью их утилизации. Антропогенные УВ, напротив, поступают в короткий период времени и локально, что приводит к негативным последствиям, нарушающим естественный круговорот этих соединений в океане (Немировская, 2000).

       1.2. Влияние нефтяного загрязнения на гидробионтов

       Основные компоненты нефти по токсичности можно распределить в таком порядке: к числу наиболее токсичных относятся ароматические УВ, менее токсичны циклопарафины, еще менее - олефины и последнее место в этом ряду занимают парафины (Квасников, Клюшникова, 1981).
       Наибольший токсический эффект на гидробионтов оказывает водорастворимая фракция нефти, которая, как предполагают, образует комплексы с белками водных организмов. Наибольшие количества этой фракции накапливают дафнии (коэффициент накопления более 500), затем гаммарусы, рыбы и моллюски. Подвержены неблагоприятному воздействию водорастворимой фракции и микроорганизмы, в частности и углеводородокисляющие (УВ-окисляющие). Такие ароматические УВ, как ксилол, толуол, нафталин, метилнафталин и фенантрен оказывают на них неблагоприятное действие даже в относительно небольших концентрациях - свыше 10 мкг/л (Пфейфере, Платпира, 1986).
       На фитопланктон нефть и нефтепродукты могут воздействовать как прямо, так и косвенно, изменяя условия среды обитания этих организмов. Толстый слой нефти на водной поверхности может поглощать до 95 % солнечной радиации, что приводит к уменьшению фотосинтеза и скорости деления клеток фитопланктонных организмов. При концентрации нефти в воде, равной 0,1 мг/л, интенсивность фиксации углерода фитопланктоном снижается на 10%. Под влиянием токсических веществ число видов

5

водорослей в водоемах уменьшается, особенно чувствительными оказались диатомовые водоросли. Фотосинтетическая активность этих организмов подавляется уже при достижении предельно допустимых концентраций (ПДК) нефтепродуктов в воде (0,05 мг/л). Что касается планктонных животных, то нефтяное загрязнение ускоряет их гибель в концентрации 0,001 мл/л.
       Нефтяное загрязнение губительно действует и на донных обитателей водоемов -на бентос. Отмечено токсическое действие на бентосные организмы нефти при концентрации ее 0,01 мг/л (Квасников, Клюшникова, 1981).
       Особенно чувствительны к воздействию' нефтепродуктов икра и личинки рыб. Личинки многих рыб должны соприкоснуться с атмосферным воздухом для заполнения плавательного пузыря. Нефть лишает их такой возможности; 1 кг ее способен образовать пленку площадью до 1 га и погубить свыше 100 млн. личинок рыб.
       Весьма актуальна в настоящее время проблема нефтяного загрязнения для тех пресных водоемов, которые имеют не только рыбохозяйственное значение, но и служат источниками питьевой воды для населения. В последнем случае требования к качеству воды резко возрастают, а нефтяные УВ способны оказывать на него весьма неблагоприятное влияние, поскольку даже при относительно малых их концентрациях вода приобретает неприятный запах и вкус и становится непригодной для использования. Известно, что вода имеет запах керосина при содержании нефти 0,2 - 0,4 мг/л, причем этот запах не устраняется даже при ее хлорировании и фильтровании. Присутствие обычных для нефти нафтеновых кислот придает воде резко выраженный запах при концентрации всего 0,01 мг/л (Алекин, 1970).

         2.        УГЛЕВОДОРОД ОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, КАК ОБЫЧНЫЙ КОМПОНЕНТ ГЕТЕРОТРОФНОГО БАКТЕРИОПЛАНКТОНА.

    Большинство живых организмов в принципе способно к окислению УВ, что связано с наличием у них ферментов оксидаз. Функции последних состоят в окислении кислородом воздуха восстановленных соединений, образующихся в клетке, таких как НАДН, НАДФ и другие. Эти ферменты и осуществляемые ими реакции представляют собой участки дыхательной цепи, функционирующей в аэробных организмах. Оксидазы могут распространять свое действие и на окисление СН₃-, СН₂- и СН-групп УВ. Поэтому незначительные количества алифатических или ароматических УВ, попавшие в организм животных или человека, окисляются имеющимися в тканях оксидазами и выводятся. Действие этого механизма, в частности - цитохрома Р-450, являющегося компонентом оксидазного комплекса, лежит в основе систем детоксикации. Однако основной вклад в процессы биохимического разрушения нефти вносят микроорганизмы, способные использовать УВ в качестве единственного иусточника углерода и энергии. Такие формы встречаются, в основном, среди аэробных микроорганизмов. Они получили название УВ-окисляющих (иногда их называют нефтеокисляющими, что не совсем верно, поскольку в состав нефти входят и соединения, не относящиеся к УВ). От других гетеротрофных микроорганизмов, многие из которых способны окислять УВ


6

побочно, в небольших количествах и только в присутствии других органических соединений, УВ-окисляющие отличаются наличием не только комплекса ферментов, окисляющих УВ, но и системы поглощения гидрофобного субстрата. В первую очередь это связано с тем, что окисление УВ происходит внутриклеточно.

    2.1. Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в водных экосистемах и их место в составе гетеротрофного бактериопланктона.

     Присутствие в большинстве водных экосистем УВ на фоновом уровне наряду со способностью УВ-окисляющих бактерий использовать кроме УВ широкий спектр лабильных органических субстратов, обуславливают практически повсеместное распространение бактерий этой группы в большинстве местообитаний, как загрязненных нефтью, так и свободных от нее. К окислению УВ способны многие гетеротрофные бактерии, выделяемые из морской воды на обычных питательных средах, не содержащих УВ. Это подтверждается данными как отечественных, так и зарубежных авторов. Так, 72,7% культур гетеротрофных бактерий, выделенных из вод Балтийского моря, обладали способностью к разрушению нефти и 78,8% - жидкого парафина. Несколько ниже были эти показатели в Беринговом море - 40,7% выделенных из него культур были способны к окислению нефти и 54,0% - жидкого парафина (Панов, 1990). Сходные данные были получены Бакли в эстуарных водах, содержание УВ в которых находилось на фоновом уровне (Buckley et al., 1976). Поэтому численность УВ-окисляющих бактерий в различных акваториях определяется теми же факторами среды, что и обычных гетеротрофных бактерий в целом - это климат (температура), наличие биогенных элементов, доступных источников углерода и другие факторы. Преимущество над остальными группами бактерий УВ-окисляющие получают при существенном загрязнении среды УВ. Нефтяное загрязнение вносит дополнительный источник углерода в экосистему и численность УВ-окисляющих бактерий возрастает до тех пор, пока другие факторы не становятся лимитирующими. По этой причине численность УВ-окисляющих бактерий всегда выше в хронически загрязненных нефтяными УВ водах, чем в свободных от загрязнения районах. Соответственно изменяется и доля этих бактерий от численности гетеротрофных бактерий, способных к росту на питательных средах. Она может варьировать от менее 0,1% до более 100% (Atlas, 1981). При аварийных разливах нефти в большинстве акваторий исходная численность этих микроорганизмов является фактором, лимитирующим скорость биодеградации У В (Ward, Brock, 1976). Однако при наличии благоприятных условий через короткий промежуток времени их количество в воде возрастает настолько, что может устранить это ограничение. В то же время при отсутствии таких условий численность УВ-окисляющих бактерий в воде может оставаться низкой, даже несмотря на присутствие в воде большого количества УВ. Подобное явление имело место после аварийного разлива мазута в порту Клайпеда в осенне-зимний период (Катастрофа танкера "Глобе Асими"..., 1990), аварии на скважине IXTOC 1 в Мексиканском заливе (Lizarraga-Partida et al., 1982), а также после выброса нефти со скважины “Экофиск” в

7

Северном море (Gunkel et al., 1985). В последнем случае в море попало 13000 - 15000 т легкой нефти с высоким содержание летучих ароматических УВ. Микробиологические данные, полученные через 1 - 5 недель после катастрофы, были сравнены с фоновыми характеристиками этой же акватории за предшествующие аварии 10 лет мониторинговых наблюдений. Оказалось, что через 5-8 суток после аварии численность УВ-окисляющих бактерий в поверхностном слое (0,5 м) воды была значительно ниже фоновых ее значений. Это могло быть связано как с токсическим действием нефти, так и с гидролого-гидрохимическими параметрами среды. Через 3-4 недели после разлива нефти численность УВ-окисляющих бактерий в поверхностном слое на порядок возрастала, однако наблюдалось ее снижение в несколько раз на двух других исследованных горизонтах - 2 и 10 м. По заключению специалистов, проводивших эти наблюдения, гидрологические условия и сезонные изменения климата по влиянию, оказываемому на численность и активность бактериальных популяций могут быть сравнимы с влиянием нефти, попавшей в морскую среду.
     Динамика численности УВ-окисляющих бактерий, также как и гетеротрофных бактерий в целом, подвержена широтно-географической, а в умеренных и полярных широтах - сезонной изменчивости. Возможны и существенные ее колебания даже в течение одного и того же месяца под влиянием локальных изменений условий среды. Так, по данным многолетних исследований С.Я. Марцинкевича (1983), выполненных в южной части Рижского залива напротив устьев рек Даугавы, Лиелупы и Гауи, во всех трех изученных районах наблюдалось резкое снижение численности УВ-окисляющей микрофлоры в августе и возрастание в октябре. При этом отмечены также постоянные колебания обилия УВ-окисляющих бактерий в разные месяцы одного и того же года, даже в период постоянно высоких или низких температур воды.
     Численность УВ-окисляющих бактерий в арктических и субарктических водах, как правило, ниже, чем в акваториях умеренных широт, однако она может заметно возрастать при попадании нефти в морскую среду (Atlas et al., 1978; Delille, Vaillant, 1990). При этом реакция микроорганизмов на нефтяное загрязнение существенно зависит от сезона - в субарктических водах она была максимальна в летний период и минимальна - в зимний (Delille, Vaillant, 1990). В арктических водах зимой поверхность воды покрыта льдом, если нефть попадает на его верхнюю или нижнюю поверхность, численность УВ-окисляющих бактерий возрастает крайне мало. Заметное, на два порядка, увеличение количества УВ-окисляющих бактерий в присутствии нефти было отмечено в арктических водах только в летний период (Atlas et al., 1978).
     Низкие величины численности УВ-окисляющих бактерий наблюдаются в открытых олиготрофных водах океана - например, в центральной части Атлантики не всегда удавалось обнаружить их присутствия даже в 1 л пробы воды (Миронов и др., 1985).
     Из сказанного выше очевидно, что гидролого-гидрохимические параметры морской среды имеют огромное влияние на распределение и численность гетеротрофных бактерий вообще и УВ-окисляющих - в частности. В то же время в большинстве рассмотренных выше работ им не уделено существенного внимания -


8