Сахарный диабет

25
3/2010

Генетика

С
С

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – заболевание, свя-
занное с дефектом иммунологической толерантно-
сти к
собственным антигенам и селективным
разрушением β-клеток панкреатических островков СD8+

(цитотоксическими) и СD4+ (эффекторными) лимфоци-
тами.
В настоящее время основной группой лимфоидных клеток,
отвечающих за поддержание аутотолерантности, считают пул

Роль регуляторных CD4+CD25+high Т-лимфоцитов
и их функциональной активности в развитии
и прогрессировании сахарного диабета 1 типа

1Никонова Т.В., 2Апанович П.В., 1Пекарева Е.В., 1Горелышева В.А., 1Прокофьев С.А., 2Карпухин А.В., 1Дедов И.И.

1ФГУ Эндокринологический научный центр, Москва 
(директор – академик РАН и РАМН И.И. Дедов )
2Медико-генетический научный центр, Москва 
(директор – академик РАМН Е.К. Гинтер)

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – заболевание, связанное с нарушением (дефектом) иммунологической толерантности к собственным
антигенам и селективным разрушением β-клеток панкреатических островков СD8+ (цитотоксическими) и СD4+ (эффекторными) лим-
фоцитами. Механизмы поддержания аутотолерантности включают CD4+CD25+high T-регуляторные клетки (Treg), супрессивная актив-
ность которых определяется экспрессией в них гена FoxP3.
Цель. Определение количественных и функциональных изменений, происходящих на уровне регуляторного звена иммунитета у лиц в группе
риска развития СД1 и у пациентов с различной длительностью СД1.
Материал и методы. В исследование было включено 116  больных (67 мужчин, 49 женщин) СД1 с различной длительностью заболевания,
33 человека (10 мужчин, 23 женщины) составили группу риска и 16 человек – контрольную группу. У всех обследуемых было проведено
HLA-генотипирование, определение аутоантител к глютаматдекарбоксилазе (ГДК), инсулину, тирозинфосфатазе, антигенам ост-
ровковых клеток, определение субпопуляционного состава лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD38+, HLA DR+, CD25+, CD4+25+ и их функ-
циональной активности (интенсивности экспрессии гена FoxP3), С-пептида, HbA1c .
Результаты. Отмечена тенденция к повышению относительного количества CD25+ и CD4+25+ T-лимфоцитов и тенденция к сниже-
нию экспрессии гена FoxP3 в группе риска по сравнению с контролем (р<0,1). В этих группах определялась достоверная разница в про-
центном содержании активационных молекул CD38 и HLA-DR+ (p<0,05). В группе больных с впервые выявленным СД количество
Т-регуляторных лимфоцитов не отличалось от такового в группе контроля (p>0,05). Однако их функциональная активность (уровень
экспрессии гена FoxP3) была достоверно ниже, чем в контроле (p<0,001). Низкая интенсивность экспрессии гена FoxP3 в сравнении
с контролем в дальнейшем отмечалась при любой продолжительности заболевания. 
Заключение. Впервые определена интенсивность экспрессии гена FoxP3 и количество CD4+CD25+hight T-регуляторных клеток при раз-
личной длительности СД. Выявлено достоверное снижение функциональной активности Т-регуляторных клеток при любой длительно-
сти заболевания, несмотря на отсутствие существенной разницы в их количестве у больных СД1 по сравнению с контрольными
значениями. У пациентов группы риска отмечено достоверное увеличение пула активированных лимфоидных клеток, повышение содер-
жания Тreg и снижение экспрессии гена FoxP3.
Ключевые слова: сахарный диабет 1 типа, группа риска, CD4+CD25+hight T-регуляторные клетки, ген FoxP3

The role of regulatory CD4+CD25+high T-lymphocytes and their functional activity in the development of type 1 diabetes mellitus
1Nikonova T.V., 2Apanovich P.V., 1Pekareva E.V., 1Gorelysheva V.A., 1Prokofiev S.A., 2Karpukhin A.V., 1Dedov I.I.
1Endocrinological Research Centre, Moscow
2Medico-Genetic Research Centre, Moscow

Type 1 diabetes mellitus (DM1) is associated with compromised (defective) immunologic tolerance to autoantigens and selective destruction of pan-
creatic B-cells by CD4+ (effector) and CD8 (cytotoxic) lymphocytes. The mechanisms of autotolerance involve CD4+CD25+high T-regulatory cells
(Treg) whose suppressor activity depends on the expression of the FoxP3 gene. 
Aim. Detection of quantitative and functional alterations at the level of regulation of immunity in subjects at risk of DM1 and patients with different
duration of DM1. 
Materials and methods. 116 patients (67 men and 49 women) with different duration of DM1. The risk group was comprised of 33 subjects (10 men
and 23 women), control group included 16 subjects. In all cases, HLA genotyping was performed, autoantibodies to GDC, insulin and tyrosine phos-
phatase, islet cell antigens were determined, subpopulation composition of CD3+, CD4+, CD8+, CD38+, HLA DR+, CD25+, CD4+25+ lymphocytes
and their functional activities (FoxP3 gene expression) studied, C-peptie and HbA1c levels measured.
Results. A tendency toward a rise in Cd25+ and CD4+25+ T-lymphocytes and a decrease in FoxP3 expression was documented in the risk group com-
pared with control (p<0.1). These groups were also significantly different in terms of percentage of CDs3 and HLA DR+ (p<0.05). Patients with newly
diagnosed DM1 had the same number of regulatory T-lymphocytes as controls (p>0.05) but their functional activity was lower (p<0.001). FoxP3 ex-
pression was impaired throughout the follow-up period. 
Conclusion. FoxP3 expression and the number of CD4+CD25+high T-lymphocytes were determined for the first time in patients with different duration
of DM1. Functional activity of regulatory T-cells was shown to decrease at any duration of the disease despite the absence of significant difference in
their counts in the patients and controls. Subjects at risk of DM1 exhibited a significant rise in the number of activated lymphoid cells and Treg along
with a reduction of FoxP3 expression.
Key words: type 1 diabetes mellitus, subjects at risk if DM1, CD4+CD25+high regulatory T-lymphocytes, FoxP3 gene

SD3_2010_C_Genetic_07_Blok  11.1.10  2:10 PM  Page 25

Сахарный диабет
Генетика

26
3/2010

СD4+ лимфоцитов, экспрессирующих СD25 маркёрную моле-
кулу – α-цепь рецептора IL-2 (IL-2R) [1]. Субпопуляцию
CD4+CD25+ называют Т-регуляторными клетками (Тreg). У че-
ловека функцию Тreg выполняют не все CD4+CD25+ лимфо-
циты, а только их фракция с высоким уровнем экспрессии
CD25 (CD4+CD25+hight). Их основная роль – контроль иммун-
ного ответа через регуляцию функции Т-эффекторных клеток
(Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток) [2].
Функциональные свойства Тreg опосредованы активностью
FoxP3 (forkhead box) [3] – фактора транскрипции, непосред-
ственно и косвенно регулирующего экспрессию более
300 генов. FoxP3 влияет на экспрессию, в том числе генов, ре-
гулирующих клеточный цикл и межклеточные взаимодействия.
Участие Тreg в регуляции аутоиммунных процессов при СД1
подтверждается фактом ассоциации СД1 с IPEX-синдромом
(Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, and
X-linked inheritance) – моногенным аутоиммунным синдромом,
сцепленным с Х-хромосомой, проявляющимся иммунной дис-
регуляцией, полиэндокринопатией и энтеропатией [3, 4, 5].
IPEX-синдром развивается в результате мутации гена FoxP3 [3,
6]. Супрессивная активность Тreg непосредственно зависит
от интенсивности экспрессии гена FoxP3 [7, 8, 9, 10]. Снижение
количества или супрессивной активности этих клеток могут
способствовать потере аутотолерантности к антигенам β-кле-
ток и развитию аутоиммунного процесса [9, 12].
В литературе приводятся достаточно противоречивые дан-
ные по характеру изменений количественных и функциональ-
ных показателей этих клеток при различных заболеваниях,
в том числе на фоне СД1.
Целью настоящей работы стало определение количествен-
ных и функциональных изменений, происходящих на уровне
регуляторного звена иммунитета у лиц в группе риска развития
СД1 и у пациентов с различной длительностью СД1.

Материалы и методы

В исследование было включено 116 больных (67 мужчин,
49 женщин) СД1 с различной длительностью заболевания,
33 человека (10 мужчин, 23 женщины) составили группу риска
и 16 человек – контрольную группу.
Больные СД1 были разделены в зависимости от длительно-
сти заболевания на следующие группы: впервые выявленный
СД1 (1-й год заболевания/после постановки диагноза) – 59 че-
ловек, с продолжительностью СД от 1 года до 5 лет – 16, от 5
до 10 лет – 15, свыше 10 лет – 26. Медиана возраста дебюта за-
болевания СД1 составила 27,0 лет [21,0; 33,0], индекс массы тела
(ИМТ)=21,88 кг/м2 [20,59; 23,93]. HbA1c в первой группе соста-
вил 9,1 % [6,4; 14,1], С-пептид – 0,7 нг/мл [0,5 ; 0,8], во второй:
HbA1c – 7,2 % [6,4; 9,8], С-пептид – 1,2 нг/мл [0,6; 1,8];
в третьей: HbA1c – 8,6 % [7,4; 9,8], С-пептид – 0,5 нг/мл [0,3;
0,8], в четвертой: HbA1c – 9,2 % [6,8; 11,9], С-пептид – 0,3 нг/мл
[0,1; 0,8].
В группу риска вошли обследованные пациенты с положи-
тельными результатами повторного определения аутоантител, ас-
социированных с развитием СД1 (GADA, IA-2A, ICA, IAA).
Пациенты были в возрасте 28,5 лет [21,5; 35,5], с ИМТ=26,03 кг/м2
[22,77; 30,15], HbA1c – 5,6% [5,4; 5,7], базальным уровнем C-пеп-
тида в крови – 1,7 нг/мл [1,2; 14,0]. У 3 человек из группы риска
родственники первой степени родства болели СД1.
Контрольную группу составили 16 практически здоровых
лиц (9 мужчин и 7 женщин), сопоставимых по возрасту с паци-
ентами исследуемых групп. Критериями включения в контроль-
ную группу были: отсутствие нарушений углеводного обмена и
отрицательные аутоантитела к антигенам β-клетки (GADA, IA-
2A, ICA, IAA). Для определения диапазона нормальных пока-
зателей интенсивности экспрессии гена Fox P3 было
обследовано 85 здоровых доноров.

Критериями исключения из исследования была вакцинация
и прием иммуномодулирующих препаратов в течение предше-
ствующего года.
Диагноз впервые выявленного СД1 ставился на основании
клинической картины и данных лабораторного обследования
в соответствии с критериями ВОЗ [13].
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови про-
водили с помощью наборов пробоподготовки «DNA prep».
ДНК-типирование выполнялось по аллельным вариантам трех
генов HLA II класса: DRB1 (14 специфичностей), DQA1 (8 ал-
лелей) и DQB1 (13 аллелей) методом мультипраймерной поли-
меразной 
цепной 
реакции 
(ПЦР). 
Для 
определения
полиморфных аллелей данных генов применялись коммерче-
ские наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология». ПЦР
проводилась согласно регламенту, указанному производителем.
Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик». Иден-
тификацию продуктов амплификации проводили после элек-
трофореза в 3% агарозном геле и окрашивания продуктов
амплификации бромистым этидием. Гаплотипы составлялись
на основе известных таблиц сцепления.
Иммунологическое исследование включало определение
аутоантител к цитоплазматическим структурам β-клеток (ICA),
к глутаматдекарбоксилазе (GADA), к тирозинфосфатазе (IA-2A)
и антиинсулиновых аутоантител (IAA). Количественное опре-
деление ICA, GADA и IAA в сыворотке крови обследованных
определяли с помощью иммуноферментных наборов «Isletest-
ICA, GADA, IAA» фирмы «Biomerica» согласно методике про-
изводителя. Количественное определение IA-2A в сыворотке
крови осуществляли методом иммуноферментного анализа
с
использованием наборов «Medizym» фирмы «Medipan
MGBH».
Содержание гликированного гемоглобина (HbA1c) опреде-
ляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
высокого давления (HPLC) на аппарате D-10 («Bio-Rad»)
по стандартной методике производителя.
Определение базальной концентрации С-пептида в крови
для оценки функционального состояния β-клеток проводили
иммунохемолюминисцентным методом на аппарате «Elecsys
2010» («Roche»).
Определение субпопуляционного состава лимфоцитов
(CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+,
CD95L+, DR+) периферической крови проводили на проточном
цитометре «FACSCalibur» с использованием моноклональных
антител одинарной и двойной меткой («Becton Dickinson»)
к дифференцировочным антигенам лимфоцитов по стандарт-
ной методике. При этом оценивали процентное содержание,
экспрессию дифференцировочных антигенов и абсолютное ко-
личество указанных субпопуляций лимфоидных клеток.
Для определения интенсивности экспрессии гена FoxP3
проводилось выделение тотальной РНК из образцов крови дан-
ных групп пациентов и получение кДНК по матрице РНК.
Определение интенсивности экспрессии гена FoxP3 было про-
ведено методом ПЦР в режиме реального времени (Real-time
PCR). Для проведения Real-time PCR были синтезированы
праймеры и отработаны оптимальные условия амплификации.
При оптимизации метода Real-time PCR был определен диапа-
зон значений, в котором соблюдается линейная зависимость
интенсивности флюоресценции от концентрации кДНК.
Статистическая обработка результатов исследования выпол-
нена с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 для
Windows. Сравнение показателей выделенных групп пациентов
проводилось по U-критерию Манна-Уитни. Корреляционный
анализ осуществлялся непараметрическим методом ранговой
корреляции по Спирмену. Количественные показатели пред-
ставлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха
[Q25; Q75]. Критический уровень значимости принимался рав-
ным 5%. 

SD3_2010_C_Genetic_07_Blok  11.1.10  2:10 PM  Page 26