Молекулярно-генетический анализ хламидий (геномика, таксономия, индикация и идентификация)

 
 
ФГОУ ВПО «КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ 

ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ им. Н.Э. Баумана» 

  

 

 

На правах рукописи 

 

 

 

ВАФИН 

 РАМИЛЬ РИШАДОВИЧ 

 
 
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХЛАМИДИЙ 

(геномика, таксономия, индикация и идентификация) 

 
 
03.00.07 – Микробиология 

 
 
Диссертация 

на соискание ученой степени доктора биологических наук 

 

 

Научный консультант: 

доктор ветеринарных наук, профессор 

Равилов Р.Х. 

 

 

 

Казань – 2009 

СОДЕРЖАНИЕ 
стр. 
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….…….7 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….....14 

1.1. Молекулярно-генетическая диагностика………..……………...…………14 

1.1.1. Методы выделения нуклеиновых кислот……..…………...………….14 

1.1.1.1. Детергентный метод……………………………………………...14 

1.1.1.2. Фенольный метод………………………………………………...15 

1.1.1.3. Фенольно-детергентный метод………………………………….16 

1.1.1.4. Сорбционный метод……………………………………………...18 

1.1.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот……………...…............18 

1.1.2.1. Полимеразная цепная реакция и ее модификации……….…….18 

1.1.2.2. Альтернативные методы амплификации………….……………26 

1.1.3. Генотипирование с учетом полиморфизма единичных нуклеотидов 

          (SNP-генотипирование)………………………………………………..32 

1.1.4. Проблема контаминации. Методы деконтаминации.................……..38 

1.2. Таксономия и номенклатура хламидий…...…………………...…………..43 

1.2.1. Семейство Chlamydiaceae………………………….…………………..46 

1.2.1.1. Род Chlamydia……………………………………………………..47 

1.2.1.2. Род Chlamydophila………………………………………………..49 

1.2.2. Семейство Parachlamydiaceae…………………………………………58 

1.2.3. Семейство Simkaniaceae………………………………………………..59 

1.2.4. Семейство Waddliaceae………………………………………………...60 

1.2.5. Семейство Criblamydiaceae……………………………………………61 

1.2.6. Хламидиозы рыб………………………………………..………………61 

1.2.7. Критический взгляд на классификацию хламидий…………………..62 

1.3. Исторический ракурс изучения проблемы хламидиозов животных 

            на постсоветском пространстве…………………….……………………..64 

1.3.1. Характеристика некоторых штаммов хламидий, выделенных 

           от млекопитающих…………………………………………………….65 

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………………….74 

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………….....74 

2.1. Штаммы хламидий. Исследованный материал……...…………………....74 

2.2. Эпизоотологическое обследование……………………………………..…76 

2.3. Выделение и идентификация возбудителя хламидиоза………………….76 

2.4. Серологические реакции……………………………………………………78 

2.5. Люминесцентная микроскопия…………………………………………….80 

2.6. Очистка и концентрирование хламидий…………………………………..81 

2.7. Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала……….......82 

2.8. ПЦР. ПДРФ. Горизонтальный гель электрофорез………………………..89 

    2.9. Секвенирование. Выравнивание и филогенетический анализ…….……104 

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………109 

3.1. Совершенствование способов генодиагностики………...…………........109 

3.1.1. Разработка способа выделения ДНК хламидий…………………….109 

3.1.2. Разработка способа проведения ПЦР...………………………….......111 

3.1.3. Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации 

           продуктами амплификации на основе разрушающего действия 

           урацил-ДНК-гликозилазы…………......…………………….…….…118 

3.2. Результаты исследования плотоядных животных на хламидиоз……....122 

3.2.1. Оценка эпизоотического состояния зверосовхоза «Вятский» 

           Кировской области РФ в отношении хламидиоза пушных зверей.122 

3.2.2. Лабораторная диагностика хламидиоза лисиц в зверосовхозе 

         «Вятский» Кировской области РФ…………………………………...124 

3.2.2.1. Вирусологические исследования………………..……………..124 

3.2.2.2. Серологические исследования…………………..……………..125 

3.2.2.3. Молекулярно-генетические исследования……..……………..126 

3.2.3. Совершенствование молекулярно-генетической индикации 

           возбудителей хламидиоза……………...…………………………….126 

3.2.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфичными 

            праймерами для индикации хламидий……...….…..…………127 

3.2.3.2. Выявление возбудителя хламидиоза в патологическом 

           материале при помощи ПЦР со специфичными праймерами.130 

3.3. Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий 

    и декоративных птиц на хламидиоз……………………………………...131 

3.4. Молекулярно-генетический анализ хламидий…….…………………….135 

         3.4.1. Сравнительная характеристика хламидий по omp1-гену….………135 

         3.4.2. Сравнительная характеристика хламидий по omp2-гену………….154 

         3.4.3. Сравнительная характеристика хламидий по 16S рРНК, 

                   23S рРНК и наличию экстрахромосомной плазмиды (pCp)…….....159 

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.………………………172 

5. ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….198 

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ…………………………………………200 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………………....203 

ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………………………………...………260 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 
ГТЦ – гуанидинтиоцианат. 
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота. 
ДСН – додецилсульфат натрия. 
ДХН – дезоксихолат натрия. 
ЖОКЭ – желточная оболочка куриных эмбрионов. 
ИФА – иммуноферментный анализ. 
КЭ – куриные эмбрионы. 
ЛПС – липополисахарид. 
МКАТ – моноклональные антитела. 
ОЛТ – орнитоз-лимфагранулема-трахома. 
ОТ-ПЦР – обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция. 
ПДАФ – полиморфизм длины амплифицированных фрагментов. 
ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. 
п.о. – пары оснований (bp – base pair). 
ПЦР – полимеразная цепная реакция. 
РИФ –реакция иммунофлуоресценции. 
РНК – рибонуклеиновая кислота. 
рРНК – рибонуклеиновая кислота рибосомная.   
РСК – реакция связывания комплемента. 
РТ – ретикулярные тельца. 
У – урацил. 
УДГ – урацил-ДНК-гликозилаза. 
УП-ПЦР – полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами. 
ФБ – фосфатный буфер. 
ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» – Федеральное Государственное Учреждение 
«Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности – 
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт». 
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота. 
ЭТ – элементарные тельца. 
A – adenosine (аденозин). 
ARMS-PCR - Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain 
Reaction 
(разновидность 
аллель-специфичной 
ПЦР 
с 
рефракторными 
праймерами. 
AS-PCR – Allele-Specific-Polymerase Chain Reaction (аллель-специфичная 
полимеразная цепная реакция). 
С – cytosine (цитозин). 
dATP – deoxyadenosinetriphosphate (дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат). 
dCTP – deoxycytidinetriphosphate (дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат). 
dGTP – deoxyguanosinetriphosphate (дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат). 
dNTPs – deoxynucleosidtriphosphates (дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфаты). 
dTTP – deoxythymidinetriphosphate (дТТФ – дезокситимидинтрифосфат). 
dUTP – deoxyuridinetriphosphate (дУТФ – дезоксиуридинтрифосфат). 
DDBJ – DNA Data Bank of Japan (Японская база данных ДНК) 

EMBL EBI – European Molecular Biology Laboratory European Bioinformatics 
Institute (Европейская лаборатория молекулярной биологии Европейского 
института бионформатики). 
FITC – fluorescein isothiocyanate (ФИТЦ – флуоресцеин изотиоционат). 
FRET – fluorescence resonance energy transfer (резонансный перенос энергии 
флуоресценции). 
G – guanosine (гуанозин). 
GPIC – guinea pig inclusion conjunctivitis agent (возбудитель хламидийного 
конъюнктивита морских свинок). 
HDA – Helicase-Dependent Amplification (хеликазо-зависимая амплификация) 
IS PCR – In Situ Polymerase Chain Reaction. 
LAMP – Loop-Mediated Isothermal Amplification (изотермическая петлевая 
амплификация). 
LDR – Ligase Detection Reaction (реакция лигазной детекции). 
LCR – Ligase Chain Reaction  (лигазная цепная реакция). 
LGV – lymphogranuloma venereum (лимфогранулема венерум). 
MoPn – mouse pneumonitis (возбудитель мышиной пневмонии). 
MOMP – Major Outer Membrane Protein (главный белок наружной мембраны). 
NASBA – Nucleic Acids Sequence-Based Amplification. 
NCBI – National Center for Biotechnology Information (Национальный Центр 
Биотехнологической Информации) 
OMP – Outer Membrane Protein (белок наружной мембраны). 
PCR –  Polymerase Chain Reaction (полимеразная цепная реакция).  
PVX – Potato Virus X. 
PVY – Potato Virus Y. 
RAPD-PCR – Random Amplification of Polymorphic DNA-PCR (произвольная 
амплификация полиморфных локусов ДНК). 
RT-PCR 
– 
Reverse 
Transcription-Polymerase 
Chain 
Reaction 
(обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция). 
SDA – Strand Displacement Amplification (амплификация с вытеснением цепи). 
SNP – Single Nucleotide Polymorphism (полиморфизм единичных нуклеотидов). 
SSCP 
– 
Single 
Strand 
Conformation 
Polymorphism 
(конформационный 
полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК). 
SSR – Single Sequencing Reaction. 
3SR – Self-sustained Sequence Replication (Самопроизвольная репликация 
последовательностей). 
Т – thymidine (тимидин). 
TAS 
– 
Transcription-based 
Amplification 
System 
(транскрипционно
опосредованная амплификационная система). 
TULIPS-PCR – Touch-Up and Loop Incorporated PrimerS (разновидность 
«Touch-Up» ПЦР с инвертированными праймерами). 
UGI – Uracil Glycosylase Inhibitor (ингибитор урацил-ДНК-гликозилазы). 
 
 

ВВЕДЕНИЕ 

Актуальность темы. Научные достижения последних десятилетий в 

области молекулярной биологии, генетики, биохимии, пересекающиеся с 

микробиологией, 
вирусологией, 
иммунологией 
и 
другими 
смежными 

дисциплинами, привели к созданию, развитию и внедрению в практику 

диагностических 
лабораторий 
молекулярно-генетических 
методов 

исследования геномов эукариот, прокариот и вирусов. Генодиагностические 

подходы, базовыми направлениями которых являются гибридизационные, 

амплификационные, сиквенсные и другие технологии ДНК/РНК-анализа, 

постоянно совершенствующиеся в плане специфичности, чувствительности, 

экономии и безопасности, позволяют осуществлять широкий спектр задач 

индикации и идентификации биологических объектов. На сегодняшний день 

они являются одними из самых эффективных приемов при постановке диагноза 

на инфекционные болезни (P. Singleton, 2000; N. Woodford et al., 2004; G.J. 

Viljoen et al., 2005; M. Klint et al., 2007; K. Sachse et al., 2008). В этом плане 

весьма актуальным представляется решение вопросов номенклатуры и 

классификации микроорганизмов, что является основой идентификации 

болезнетворных агентов. 

Хламидиозы – группа разнообразных по проявлению контагиозных 

болезней животных, возбудителями которых являются внутриклеточные 

микроорганизмы со своеобразным циклом развития (J. Storz, 1988). Геномы 

хламидий являются перспективным объектом исследования, а генетический 

критерий идентификации служит одной из конструктивных звеньев построения 

их классификации (K.D. Everett et al., 1999a, 1999b; J.C. Hartley et al., 2001; M. 

Van Loock, 2003; N.R. Thomson et al., 2005, 2008; R.S. Stephens et al., 2009). 

Особенностью хламидиозов, значительно усложняющей контроль за 

развитием заболевания, является частое латентное или хроническое течение со 

стертой клинической картиной. Кроме того, обладая низкой иммуногенностью, 

не обеспечивающей выработку достаточного количества антител, инфекция 

часто приобретает персистирующий характер и способствует образованию 

тлеющего очага.  

Лабораторные 
методы 
диагностики 
хламидиоза, 
основанные 
на 

обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, 

выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в 

сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, 

имеют 
ряд 
недостатков, 
связанных 
с 
низкой 
чувствительностью 
и 

специфичностью, а также длительностью получения ответа. Это обусловливает 

необходимость изыскания и внедрения чувствительных средств диагностики, 

позволяющих 
выявлять 
хламидии 
при 
любой 
форме 
проявления 

инфекционного процесса (J.C. Hartley et al., 2001; K. Sachse et al., 2009). 

Исходя 
из 
этого, 
перспективным 
направлением 
является 

совершенствование 
лабораторной 
диагностики 
хламидиозов 
на 
основе 

молекулярно-генетических методов исследования. 

Цель и задачи исследования. Цель исследования – создание научно
практических основ генодиагностики биологических объектов и проведение 

системного молекулярно-генетического анализа хламидий на предмет их 

таксономической принадлежности. 

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие 

задачи: 

− разработать способ выделения нуклеиновых кислот хламидий для получения 

препаратов ДНК высокой степени чистоты и нативности; 

− разработать способ проведения ПЦР, обеспечивающий эффективную 

наработку 
специфичных 
ампликонов 
с 
исключением 
амплификации 

неспецифичных продуктов реакции; 

− разработать способ деконтаминации амплификационных реакций на основе 

урацил-ДНК-гликозилазного метода защиты от контаминации; 

− провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли 

хламидий в патологии клеточных пушных зверей, птиц, рептилий и амфибий;  

− подобрать условия проведения индикации и идентификации хламидий в 

клиническом и патологическом материале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ
анализа; 

− провести молекулярно-генетические исследования типичных представителей 

рода Chlamydophila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» на 

предмет их таксономической принадлежности на основании сравнительного 

анализа по omp1-, omp2-, 16S рРНК- и 23S рРНК-генам с соответствующими 

фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидий, а 

также по наличию экстрахромосомной плазмиды. 

Научная новизна.  

− Впервые на основании системного молекулярно-генетического анализа 

представителей  семейства Chlamydiaceae охарактеризован новый, ранее не 

изученный генотип хламидий, обозначенный нами «генотип G», с 

предложением соотнесения изолированных от млекопитающих при абортах 

штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» рода Chlamydophila в 

новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov. 

- Разработка фенольно-детергентного способа выделения ДНК хламидий 

(Патент РФ на изобретение № 2230120 – «Способ выделения ДНК 

микроорганизмов»). 

− Разработка методики высокоточной ПЦР (Патент РФ на изобретение № 

2299240 – «Способ проведения ПЦР»). 

− Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами 

амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы 

(из E. coli) (Патент РФ на изобретение № 2307167). 

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены 

охраноспособными 
документами, 
отражены 
в 
публикациях 
ведущих 

рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК и глобальной 

электронной базе данных генбанков NCBI (США), EMBL (Великобритания), 

DDBJ (Япония). 

Научно-практическая значимость. 

− Результаты 
молекулярно-генетических 
исследований 
типичных 

представителей рода Chlamydopila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» 

и «КС-93», характеризующие собой новый, ранее не изученный генотип 

хламидий («генотип G»), с предложением выделения изученных штаммов в 

новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov., существенно 

повышают уровень знаний о природе хламидийных инфекций и позволяют 

эффективно использовать полученную информацию в научно-практической 

деятельности ветеринарной и гуманитарной медицины. 

− Разработан 
способ 
выделения 
ДНК 
хламидий 
для 
последующего 

молекулярно-генетического 
анализа. 
Предложенная 
разновидность 

фенольно-детергентного 
метода 
экстракции 
нуклеиновых 
кислот 

микроорганизмов проста в эксплуатации, экономична во времени и 

средствах, дает приемлемые результаты в отношении нативности, чистоты и 

концентрации препаратов ДНК хламидий. 

− Разработан способ проведения полимеразной цепной реакции, являющийся 

действенной альтернативой разновидностям «точной» ПЦР, таким как 

«touch-up PCR» и «touch-down PCR». Предложенная методика высокоточной 

ПЦР позволяет значительно повысить специфичность амплификации 

интересуемых участков геномов исследуемых биологических объектов. 

− Разработан способ ферментативной деконтаминации амплификационных 

реакций на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из E. 

coli). Предложенный подход является действенным инструментом защиты 

ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа» от загрязнения продуктами 

амплификации. 

− Установлена хламидийная природа различных патологий у клеточных и 

домашних плотоядных животных, птиц, рептилий и амфибий; выделенные 

при этом изоляты микроорганизмов идентифицированы как хламидии. 

− Подобраны условия проведения ПЦР-индикации и идентификации хламидий 

методом ПЦР-ПДРФ в исследуемом биоматериале, обеспечивающие 

высокую чувствительность и специфичность тестов. 

− Подготовленные на основе научно-практической работы методические 

рекомендации используются в учебном процессе факультетов ветеринарной 

медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации 

специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях. 

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: 

− ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская 

государственная академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (2002
2008 гг.); 

− ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ГНУ «Татарский научно
исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (2004-2006 гг.); 

− Всероссийской 
научно-практической 
конференции 
по 
актуальным 

проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань 2002 г.); 

− научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и 

ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Киров, 2002 г.); 

− X-XII, XIV и XV Московских международных ветеринарных конгрессах 

(Москва, 2002-2004, 2006, 2007 гг.); 

− IV региональной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. 

Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2004 г.); 

− научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних 

животных» (Казань. 2005 и 2006 гг.); 

− научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО «Казанская 

академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2006 г.). 

Публикация 
результатов 
исследования. 
По 
теме 
диссертации 

опубликовано 55 работ, в том числе 10 публикаций в ведущих рецензируемых 

научных журналах, рекомендованных ВАК, 4 методические рекомендации, 3 

патента на изобретения, 1 монография и 15 депонированных в глобальных 

базах данных генбанков NCBI, EMBL и DDBJ публикаций нуклеотидных 

последовательностей локусов omp1-, omp2-, 16S рРНК-, 23S рРНК-генов и 

экстрахромосомной плазмиды хламидий штамма «Ростиново-70». 

Основные положения, выносимые на защиту: 

− Штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» рода 

Chlamydophila по генетическому (анализ omp1-, omp2-, 16S рРНК- и 23S 

рРНК-генов 
хламидий 
и 
наличия 
экстрахромосомной 
плазмиды) 
и 

экологическому (изолированы от млекопитающих при абортах) критериям 

охарактеризованы как ранее не изученный генотип («генотип G») и 

предложены для выделения в новый вид – Chlamydophila parapsittaci sp. nov. 

− Фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий позволяет 

получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых 

кислот возбудителя. 

− Методика высокоточной ПЦР обеспечивает эффективную наработку 

специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных 

продуктов реакции. 

− Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на 

основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из E. coli) 

предотвращает 
возможность 
реамплификации 
урацил-содержащих 

ампликонов при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте 

«1 пробирка, 2 этапа». 

− Различные патологии у клеточных и домашних плотоядных животных, 

декоративных птиц, рептилий и амфибий имеют хламидийную природу, 

подтвержденную результатами комплексных исследований. 

− Подобранные условия индикации и идентификации хламидий в исследуемом 

биоматериале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ обеспечивают высокую 

чувствительность и специфичность анализа. 

 

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 

290 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 

2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) 

и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 

результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, 

выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 

470 источников, в том числе 416 иностранных) и приложения. Диссертация 

иллюстрирована 21 таблицами, 30 рисунками и 8 схемами. Прилагаются 

документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.