Основы микротехники и гистохимии. Учебно-методическое пособие

����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

ÎÃËÀÂËÅÍÈÅ

Предисловие ..........................................................................................6

МИКРОТЕХНИКА ..............................................................................8
Принципы организации работы
в гистологической лаборатории ....................................................8
Этапы работы в гистологической лаборатории ..........................8
Оборудование и предметы, необходимые для работы 
в учебной гистологической лаборатории ....................................9
Подготовка предметных стекол ..................................................12
Взятие материала для изучения ..................................................13
Фиксация .........................................................................................15
Вещества, используемые для приготовления фиксаторов .......18
Альдегидные фиксаторы .............................................................20
Формальдегид (формалин)......................................................20
Параформальдегид ..................................................................22
Забуференный нейтральный раствор 
формальдегида (рН 7,0) по Лилли .........................................23
Быстрая фиксация формальдегидом ......................................23
Фиксатор Замбони для электронно-микроскопической 
иммуноцитохимии ...................................................................24
Глутаровый альдегид ...............................................................25
Спиртовые фиксаторы .................................................................26
Этиловый спирт и ацетон........................................................26
Метиловый спирт.....................................................................27
Фиксатор ФСУ (формалин-спирт-уксусная кислота) 
по Бродскому ............................................................................28
Фиксатор Карнуа ......................................................................28
Кальций-формол по Бекеру.........................................................29
Фиксатор Буэна ............................................................................29
Тетраоксид осмия (OsO4) ............................................................30
Фиксатор для трудно пропитываемых объектов .......................32

Т.В. Васильева Основы микротехники и гистохимии

Фиксирующие жидкости с содержанием солей 
тяжелых металлов ........................................................................32
Жидкость Ценкера ...................................................................33
Постфиксация ..............................................................................34
Фиксаторы для иммуногистохимического исследования ........34
Фиксация по Стефанини, де Мартино, Замбони 
(забуференная жидкость Буэна) .............................................35
Фиксация в растворе бензохинона по Полаку-Блуму ..........35
Заливка материала ........................................................................36
Обезвоживание .............................................................................36
Заливочные среды ........................................................................38
Парафин ....................................................................................38
Целлоидин ................................................................................40
Целлоидин-парафин ................................................................41
Поливиниловый спирт по Федеру 
в модификации Вахштейна .....................................................42
Заливка в полиэтиленгликоль (карбовакс) ............................43
Желатин ....................................................................................44
Заливка в агар по Лилли .........................................................45
Изготовление и окрашивание гистологических срезов ..........45
Гистологические красители .........................................................49
Метахромазия ...............................................................................53
Красители и методики окрашивания 
гистологических препаратов ......................................................53
Окраска по Романовскому .......................................................53
Гематоксилин ...........................................................................54
Гематоксилин Караччи ............................................................55
Железный гематоксилин по Гейденгайну ..............................56
Кармин ......................................................................................58
Спиртовой борный кармин .....................................................58
Квасцовый кармин ...................................................................59
Сафранин ..................................................................................59
Эозин .........................................................................................60
Светлый зеленый .....................................................................60
Окраска по Маллори ...............................................................60
Окраска по Маллори в модификации Гейденгайна (азан) ........63
Окраска по Ван-Гизону ...........................................................64
Активные красители в биологии ................................................65
Прижизненная окраска ................................................................66
Заключение срезов .........................................................................68
Обезвоживание препаратов .........................................................68
Заключение в смолу .....................................................................69

Оглавление

Водорастворимые среды для заключения срезов .....................70
Глицерин-желатин ...................................................................71
Глицерин ...................................................................................71
Мовиол ......................................................................................72
Гумми-сироп Апати .................................................................72

ГИСТОХИМИЯ ..................................................................................73
Реакция на кислую фосфатазу (метод Гомори, 1950 г.)............76
Реакция на сукцинатдегидрогеназу по Нахласу, 
Валькеру и Зелигману (1957 г.)...................................................78
Выявлени е РНК по методу Браше ..............................................80
Реакция Фельгена ........................................................................83
Выявление гликогена по Шабадашу ..........................................86
Реакция на нейтральный жир по Дадди ....................................87
Выявление кислых мукополисахаридов 
альциановым синим по Стидмену .............................................89

Дополнительная литература ............................................................92

Приложение .........................................................................................93

ÏÐÅÄÈÑËÎÂÈÅ

Бурное развитие науки в последние десятилетия, в значительной 
степени, определялось появлением новых методов исследования. 
Этот процесс затронул и «классические» биологические дисциплины, 
в том числе и гистологию, которая еще недавно воспринимались 
многими как наука завершенная, а потому — неактуальная. 
Появление новых типов микроскопов, внедрение молекулярно-
биологических методик, методов анализа транскриптомов и т.п. позволяет 
ставить и решать принципиально новые задачи. Однако внедрение 
современных методов не снижает важности классических 
подходов. Причем, именно с освоения таких методов обычно начинается 
подготовка студентов, специализирующихся в области клеточной 
биологии, гистологии и некоторых других наук. В этом им 
поможет книга Тамары Викторовны Васильевой «Основы микротехники 
и гистохимии». Более 60 лет творческой жизни Тамары Викторовны 
связаны с МГУ имени М.В. Ломоносова: сначала учеба на 
Биологическом факультете МГУ, затем работа в группе академика 
Н.Г. Хрущева на кафедре клеточной биологии и гистологии. Тамара 
Викторовна — автор более 120 статей, которые посвящены изучению 
разных аспектов организации тканей животных в норме и при 
развитии патологических процессов.
На протяжении 30 лет Тамара Викторовна ведет ключевой для кафедры 
клеточной биологии и гистологии практический курс, в рамках 
которого студенты узнают и осваивают базовые методы подготовки 
гистологических препаратов. Именно этот курс позволяет получить 
навыки, которые, в значительной степени, определяют специфику 
подготовки на кафедре. Однако уже давно ощущается дефицит 
учебной литературы, которая бы могла помочь студентам освоить 
этот важный, но достаточно сложный курс. Книга Тамары Викторовны 
позволяет решить эту проблему.
В пособии последовательно рассматривается весь теоретический 
материал, который необходим для работы в учебной гистологической 

Предисловие

лаборатории и базовые методы микротехники и гистохимии. Книга 
содержит как краткие описания принципов используемых методов, 
так и подробные протоколы всех проводимых студентами реакций. 
Дополнительно приводятся прописи некоторых фиксаторов и красителей, 
которые не используются на практикуме из-за ограниченности 
времени или правил техники безопасности.
В последние десятилетия микротехника стремительно менялась. 
Автоматизация процессов проводки и окрашивания изменили стиль 
работы в гистологических лабораториях, но при обучении студентов 
важно провести каждый этап руками, прочувствовать смысл происходящих 
реакций. Это создает основу, которая дает возможность творчески 
работать с методами микротехники и гистохимии.
Важно подчеркнуть, что приведенные протоколы были многократно 
опробованы в ходе проведения практикума. Поэтому пособие может 
служить удобным справочником по базовым методам работы в 
гистологической лаборатории, что, впрочем, не отменяет необходимости 
подбирать условия окрашивания в каждом конкретном случае.
Можно надеяться, что эта замечательная книга окажется полезной 
для новых поколений студентов, осваивающих методы микротехники 
и гистох имии, а также будет полез на для всех, кто применяет гистологические 
методики в свое й научной работе.

Заведующий кафедрой клеточной биологии и гистологии 
Биологического факультета МГУ, профессор, д.б.н.
Г.Е. Онищенко

Профессор кафедры клеточной биологии и гистологии 
Биологического факультета МГУ, д.б.н.
Е.В. Шеваль

ÌÈÊÐÎÒÅÕÍÈÊÀ

Ïðèíöèïû  îðãàíèçàöèè ðàáîòû 
â ãèñòîëîãè÷åñêîé ëàáîðàòîðèè

Ýòàïû ðàáîòû â ãèñòîëîãè÷åñêîé ëàáîðàòîðèè

Процесс приготовления гистологических препаратов требует достаточно 
больших затрат времени и сил. При этом необходимо соблюдать 
ряд базовых требований к организации работы в лаборатории, 
которые касаются как обеспечения безопасности работы, так и документирования 
результатов работы: проведение всех процедур в чистых, 
оснащенных вытяжными шкафами помещениях, работа в специальной 
одежде (лабораторных халатах, при необходимости фартуках), 
недопустимость работы в помещениях и на столах, где едят и т.д. 
Обязательным и непреложным условием является ведение рабочего 
журнала, в котором протоколируются основные действия, приводится 
расшифровка образцов, отмечаются любые, даже мельчайшие отступления 
от исходного протокола работы. Отработанные растворы, обязательно 
сливаются в особые маркированные емкости, которые сд а-
ются для утилизации.
Работа с гистологическими препаратами включает следующие 
этапы:
● забор материала;
● фиксация, обезвоживание материала;
● заливка в парафин (или другую среду);
● изготовление блоков;
● приготовление срезов;
● окрашивание срезов;
● заключение срезов под покровное стекло;
● микроскопический анализ;
● хранение (архивирование) препаратов .

Микротехника

Четкая организация работы и зонирование основных процессов 
является необходимым условием для стабильной работы любой гистологической 
лаборатории. Усилия по предварительной подготовке 
к работе и ее разумной и безопасной организации позволяют экономить 
время и ресурсы, добиваться стабильного получения качественных 
и информативных препаратов.

Îáîðóäîâàíèå è ïðåäìåòû, íåîáõîäèìûå 
äëÿ ðàáîòû â ó÷åáíîé ãèñòîëîãè÷åñêîé ëàáîðàòîðèè

Каждый из этапов работы требует наличия определенного оборудования 
и реактивов, которые должны быть готовы до начала работы 
с биологическим материалом. Перед началом работы в учебной лаборатории 
необходимо составить список всего необходимого и убедиться 
в наличии всех расходуемых материалов, посуды, приборов. Необходимо 
постоянно поддерживать приборы в работоспособном состоянии 
и контролировать наличие всех необходимых материалов. 
В современных лабораториях многие процессы подготовки образцов 
автоматизированы, однако в учебной лаборатории все процедуры проводятся 
вручную. Это серьезным образом влияет на характер организации 
работы. Ниже приводится примерный перечень необходимых приборов 
и расходуемых материалов, позволяющих организовать работу 
учебной гистологической лаборатории. В списке не приводятся красители 
и реактивы для постановки гистохимических реакций.
Оборудование:
● водяная баня;
● холодильник;
● нагревательный столик;
● лупа настольная;
● термостаты на 37 °С и 56 °С;
● магнитная мешалка;
● весы;
● автоматические пипетки;
● шпатели;
● рН-метр;
● ротационный микротом;
● вытяжной шкаф;
● дистиллятор;
● криотом;
● микроскопы;
● бинокуляр;
● настольные лампы (для каждого студента).

Т.В. Васильева Основы микротехники и гистохимии

Средства поддержания чистоты:
● халат (у каждого студента свой);
● полотенце (удобны бумажные полотенца в листах или рулонах);
● неопудренные одноразовые перчатки;
● полотенце из хлопка для высушивания стекол после мытья;
● средства для мытья посуды — жидкое средство, мыло, кальцинированная 
сода;
● мыло для рук;
● салфетки для протирания пыли на рабочем месте;
● пластиковая салфетка (50х30 см) на стол.
Посуда и лабораторные мелочи:
● мерные цилиндры 5, 10, 50, 100 мл;
● стеклянные воронки разного диаметра;
● посуда для фиксатора с притертой пробкой;
● емкость для слива отработанной жидкости (стеклянная бутыль);
● емкости для промывки;
● колбы из термостойкого стекла;
● спиртовка;
● проводка для предметных стекол (6 стаканов с притертыми пробками 
и 2 стакана без крышек для дистиллята и проточной воды в деревянном 
штативе);
● пенициллиновые флаконы для фиксации материала, для красителей;
● 
пипетки-груши;
● градуированные стеклянные пипетки;
● несмываемый маркер;
● рельсы для окраски препаратов;
● наездники для закладки 6 предметных стекол в гистологический 
стакан в процессе депарафинирования срезов;
● предметные стекла (удобнее с матированным краем);
● предметные стекла с адгезивным покрытием;
● покровные стекла;
● чашки Петри большие стеклянные, маленькие пластиковые;
● препаровальные иглы 2 штуки на человека и 6 штук для вскрытия 
животного;
● бинт;
● нитки;
● марля;
● вата;
● плотная бумага для этикеток;
● бумага для изготовления коробочек;
● этикетки для наклейки на деревянные блоки;

Микротехника

● простой карандаш;
● деревянные блоки (~10 штук на человека);
● спички/зажигалка;
● тонкий резиновый или силиконовый шланг на лезвие ножа;
● контейнеры и планшеты для хранения препаратов;
● ванночка с парафином для вскрытия животных;
● эксикатор;
● посуда с притертой пробкой для хранения чистых стёкол в спирте 
с эфиром;
● стеклянные глазные палочки ~5 штук (на всю группу) для нанесения 
белка и бальзама на предметные стекла;
● Стеклянные флаконы с завинчивающимися крышками для «каши»;
● пластиковые плашки для пропитки материала парафином.
Расходуемые материалы:
● одноразовые микротомные ножи;
● фильтровальная бумага.
Реактивы:
● дистиллированная вода;
● изопропиловый спирт;
● 96°-ный этиловый спирт;
● абсолютный этиловый спирт;
● канадский бальзам или другая среда для заключения препарата;
● толуол или ксилол;
● белок для наклейки срезов; 
● хлороформ;
● парафин (гистомикс)
● иммерсионное масло.
Инструменты:
● пинцет большой;
● пинцет малый;
● пинцет хирургический малый; 
● пинцет анатомический малый;
● скальпель;
● ножницы;
● ножницы для бумаги;
● лезвия безопасной бритвы;
● шприцы;
● иглы. 
Аптечка:
● кровоостанавливающая губка;
● лейкопластырь с антисептиком; 
● стерильный бинт; 

Т.В. Васильева Основы микротехники и гистохимии

● нестерильный бинт; 
● салфетки, пропитанные спиртом; 
● жгут;
● спрей от ожогов; 
● стерильная вата;
● активированный уголь. 
Журнал и инструкции по технике безопасности.

В учебной лаборатории должны быть организованы следующие рабочие 
места:
● пространство для мытья посуды;
● пространство для работы с летучими реактивами (вытяжной шкаф);
● пространство для работы в термостатах;
● индивидуальные рабочие места с микротомами и микроскопами.
Перед началом работы необходимо проверить наличие всего необходимого 
оборудования и расходуемых материалов.

Ïîäãîòîâêà ïðåäìåòíûõ ñòåêîë

1. Новые предметные стекла мыть горячей водой с мылом, сполоснуть 
дистиллированной водой, протереть, хранить в спирте с эфиром (
100:1).
2. Грязные предметные стекла и посуду, особенно после красителей, 
моют хромпиком (смесью концентрированной серной кислоты и 
бихромата калия). Работать в халате, перчатках, очках, нарукавниках 
и противокислотном фартуке.
2.1. Вымыть стекла или посуду в горячей воде с мылом.
2.2. Протереть стекла насухо, а посуду высушить.
2.3. Положить стекла или посуду в хромпик, в закрытом эксикаторе (
K2Cr2O7 — 100 г, H2SО4 — 100 мл) на 2–3 дня. Рабочий раствор 
хромпика должен иметь темно-коричневый цвет. В случае 
попадания в хромпик воды, раствор приобретает зеленый цвет и 
перестает работать.
2.4. Промыть проточной водой 24 ч, затем сполоснуть в дистиллированной 
воде, насухо протереть.
2.5. Хранить в спирте с эфиром.
3. Покровные стекла моют с мылом и горячей водой. Насухо протирают 
и хранят в зак рытых чашках Петри.

Микротехника

Âçÿòèå ìàòåðèàëà äëÿ èçó÷åíèÿ

Подготовка образцов в гистологии требует получения неизмененных 
образцов тканей, что достигается быстрой эвтаназией лабораторного 
животного. Эвтаназия строго регулируется актуальными законами 
и принятым регламентом обращения с лабораторными животными.  
Выбор типа терминального наркоза, способа введения и дозировки обусловлены 
целями эксперимента, но важно также учитывать необходимость 
избегания стресса и болевых ощущений у животных. Эвтаназия 
с применением терминального наркоза должна осуществляться обученным 
персоналом в специальном помещении, изолированном от места 
размещения других лабораторных животных. Следует учесть, что 
правила обращения с животными регламентируют тип терминального 
наркоза и способ эвтаназии для каждого вида лабораторных животных. 
Эвтаназия может осуществляться с применением физического воздействия, 
ингаляционного или инъекционного типов наркоза.
Рекомендуемый способ эвтаназии рыб, амфибий включает премедикацию 
и собственно, эвтаназию. 
– премедикация и эвтаназия рыб: помещение в раствор тримекаина 
(0,2 г/л или более) до прекращения жаберных движений с последующим 
физическим разрушением головного мозга (удар по голове);
– премедикация и эвтаназия амфибий: подкожная инъекция местного 
анестетика (лидокаин, 2% 1 мл/ 100 г) с последующим физическим 
разрушением головного мозга (удар по голове, разрушение головного 
мозга зондом);
– премедикация и эвтаназия рептилий: быстрое разрушение головного 
мозга с помощью физического воздействия. Для рептилий недопустима 
декапитация.
Рекомендуемый способ эвтаназии варьирует для различных видов 
млекопитающих.
– эвтаназия лабораторных мышей и крыс весом до 150 г возможна 
с помощью декапитации. Рекомендуемым методом эвтаназии для 
данных животных является СО2-эвтанация. Для осуществления 
этого метода животных помещают в закрытую камеру, которую в 
течение минимум 15 мин продувают газовой смесью СО2 (70%) и 
О2 (30%). Диоксид углерода в высокой концентрации одновременно 
подавляет активность дыхательного центра и обладает наркотическим 
эффектом. Наличие О2 в газовой смеси необходимо для предотвращения 
удушья.
– эвтаназия лабораторных крыс, весом от 150 г, морских свинок возможна 
с помощью СО2-эвтаназии. Возможна премедикация одним