Полиморфизм гена CTLA4 (49A/G) в русской популяции у больных сахарным диабетом 1 типа и здоровых доноров

СС

ахарный диабет 1 типа (СД 1) – аутоиммунное
заболевание, существенная роль в развитии
которого принадлежит наследственной предрасположенности. Генетически обусловленная предрасположенность к развитию СД 1 связана в основном с
полиморфизмом региона HLA класса II, однако существует целый ряд не относящихся к HLA генов, полиморфизм которых также может быть связан с развитием СД 1. Одним из генов-кандидатов является ген
CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4,
поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов), белковый продукт которого участвует в регуляции активности Т-лимфоцитов и, следовательно,
может играть важную роль в развитии аутоиммунных
процессов. Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33,
содержит 4 экзона и три интрона; полиморфизм гена
обусловлен, в частности, полиморфизмом одиночного
нуклеотида (SNP) +49A/G в первом экзоне (замена аденина на гуанин в 49 позиции последовательности первого экзона, приводящая к замене треонина на аланин в 17
позиции аминокислотной последовательности белка). 
При исследовании различных популяций были получены данные, как подтверждающие [1–6], так и не подтверждающие [7–9] ассоциацию СД 1 с полиморфизмом +49 A/G гена CTLA4. 
В данной статье представлены результаты работы
по изучению распространения полиморфизма 49A/G
гена CTLA4 (rs231775) в русской популяции у больных
CД 1 и у здоровых доноров. 

Материалы и методы исследования

В исследовании использовали коллекции периферической крови детей в возрасте 5–12 лет с диагнозом
СД 1 (50 образцов, москвичи) и здоровых доноров
крови (71 образец, москвичи). 
ДНК выделяли методом Higuchi (1989) с некоторыми модификациями: 0,5 мл крови, взятой на EDTA, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках с
0,5 мл лизирующего раствора (0,32М сахарозы, 10 мМ
Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100) и центрифугировали в течение 1 мин при 10 000 об./мин.
Супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза
отмывали указанным буфером. Последующий протео
лиз проводили в 50 мкл буферного раствора (50 мМ
KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5 мМ MgCl, 0,45% NP40,
045% Твин 20 и 250 мкг/мл протеиназы К) при 37°С в
течение 20 мин. Протеиназу К инактивировали  кипячением в течение 5 мин в водяной бане. Полученные
образцы ДНК сразу использовали для типирования,
либо хранили при –20°С. Концентрация ДНК, определяемая по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНКминифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем
50–100 мкг/мл. 
Для генотипирования по локусам HLA-DRB1, 
-DQA1, -DQB1 применяли наборы реагентов производства НПФ ДНК-Технология (Москва).
Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G
(rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 был применен
метод сиквенс-специфических праймеров с определением продуктов амплификации в режиме «реального
времени» [10].
Равное количество ДНК, выделенной из каждого
образца, вносили в две амплификационные пробирки,
содержащие праймер специфичный для аллеля A (пробирка с амплификационной смесью № 1) или аллеля G
(пробирка с амплификационной смесью № 2), амплификационные смеси также содержали одинаковый обратный праймер и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.
Учет результатов проводили после окончания реакции амплификации. Результат генотипирования определяли по разнице пороговых циклов (ΔCt), полученных для амплификационных смесей № 1 и № 2. В случае
гетерозиготы ΔCt была близка к нулю, в случае гомозигот ΔCt составляла более 5.
Для детекции однонуклеотидной замены 49 A/G
(rs231775) в первом экзоне гена CTLA4 были разработаны и синтезированы следующие праймеры: специфичный для аллеля A (5’- CAA ggC TCA gCT gAA CCT
ggC TA –3’); специфичный для аллеля G (5’- CAA ggC
TCA gCT gAA CCT ggC Tg –3’); общий праймер
(5’- TCA CTg CCC TTg ACT gCT gAA ACA -3’). Также
был синтезирован флуоресцентно-меченый ДНК-зонд
(FAM-5’- ggA CCT ggC CCT gCA CTC TCC Tg 
-3’-BHQ1). При разработке дизайна олигонуклеотидовов использовались базы данных нуклеотидных последовательностей Gen Bank, dbSNP и программное обеспечение Oligo 6.0.

2
3/2007

Полиморфизм гена CTLA4 (49A/G) 
в русской популяции у больных 
сахарным диабетом 1 типа и здоровых доноров

Д.Д. Абрамов1, И.И. Дедов2, Д.Ю. Трофимов3, М.Н. Болдырева1, Т.Л. Кураева2, Л.П. Алексеев1

1ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России», Москва

2ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий, Москва

3ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва

Генетика