Атомно-силовая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях


С.Н. ПЛЕСКОВА

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ









Издательский Дом
ИНТЕЛЛЕКТ

ДОЛГОПРУДНЫЙ
2011

    С.Н. Плескова
      Атомно-силовая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях: Учебное пособие / С.Н. Плескова — Долгопрудный: Издательский Дом «Интеллект», 2011. — 184 с.
      ISBN 978-5-91559-108-9

      В учебном пособии рассмотрены не только устройство и принципы работы сканирующего зондового микроскопа, но и вопросы исследования биологических объектов, в частности нуклеиновых кислот, белков и белок-мембран-ных комплексов, бактериальных клеток и субклеточных структур. Книга представляет безусловный интерес, поскольку автор излагает результаты собственных исследований, в том числе технические проблемы, возникающие при исследовании биологических объектов.
      При изучении биологических образцов принципиальным вопросом является наблюдение в физиологических средах, где сохраняется нативность клеток и тканей. Метод АСМ предоставляет возможность исследования живых клеток без фиксации, при этом с высоким разрешением. Основываясь на опыте работы, в книге суммируются разработанные методические подходы и полученные результаты по изучению эукариотических клеток в оптимальной для них среде.
      Книга не имеет аналогов в научной и учебной литературе на русском языке.
      Для научных работников, студентов и преподавателей биологических и физико-химических специальностей.



















ISBN 978-5-91559-108-9

        © 2011, С.Н. Плескова
        © 2011, ООО «Издательский Дом «Интеллект», оригинал-макет, оформление

                ОГЛАВЛЕНИЕ









Введение.......................................................6

Глава 1
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ................................................... 9

   1.1. Механические элементы атомно-силового микроскопа. 10
   1.2. Оптическая система атомно-силового микроскопа........ 14
   1.3. Система обратной связи и корректировки сигнала....... 15
   1.4. Режимы: (моды) сканирования объектов................. 17
       1.4.1. Контактный режим сканирования.................. 18
       1.4.2. Колебательный (резонансный) режим сканирования. 23
       1.4.3. Режим фазового контраста....................... 27
   1.5. Формирование АСМ-изображений..........................29
   1.6. Особенности сканирования вжидкости................... 30

Глава 2
ОСОБЕННОСТИ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ......................... 36

   2.1. Выбор подложки и фиксация образца.................... 40
   2.2. Иммобилизация нуклеиновых кислот..................... 42
   2.3. Иммобилизация белковых молекул....................... 45
   2.4. Фиксация клеток для сканирования в воздушной среде и иммобилизация для исследования в жидкости........ 50
   2.5. Выбор зондов для сканирования медико-биологических объектов........................................... 56

Оглавление

Глава 3
ИССЛЕДОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ВИРУСОВ МЕТОДОМ АСМ........................................ 63
   3.1. Исследование ДНК........................... 63
   3.2. Исследование вирусов....................... 74

Глава 4
АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ
ПРОКАРИОТ, НИЗШИХ ЭУКАРИОТ, БЕЛКОВ И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ....................... 87
   4.1. Исследование микроорганизмов............... 87
   4.2. АСМ-исследование белков и надмолекулярных комплексов......................................103

Глава 5
АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ КЛЕТОК МАКРООРГАНИЗМОВ.............................117
   5.1. Исследование фиксированных эукариотических клеток и тканей.........................................117
   5.2. Исследование нативных эукариотических клеток и тканей.........................................131
   5.3. FS-спектроскопия и определение ригидности живых клеток...........................................144

Глава 6
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА АСМ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ..............................153
   6.1. Исследование специфических бактериальных белков.154
   6.2. Перфорация клеток и использование зондов в качестве наноигл.........................................156
   6.3. Конструктивная модификация зонда...........159
   6.4. Высокоскоростная АСМ-микроскопия...........162

Оглавление —I 5

Приложение
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АСМ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ................................165


Заключение.................................................172


Список источников, использованных при подготовке книги и рекомендуемых для углубленного изучения предмета...........173

                ВВЕДЕНИЕ










           Конец XX, начало XXI веков ознаменовались появлением нового направления науки — нанотехнологии. Качественное отличие современной нанотехнологии от тех исследований, которые ранее проводились на молекулярном и атомарном уровне, заключается в том, что сейчас приборная база позволяет не только рассматривать невидимый (10⁻⁹ м!) мир, но и достаточно свободно преобразовывать его. Уникальным методом, позволяющим передвигать атомы по поверхности, является сканирующая зондовая микроскопия. Использовать сканирующий туннельный микроскоп для написания аббревиатур своих лабораторий отдельными атомами (например, золота) на поверхности стало одной из любимых забав ученых. Но если можно двигать атомы по поверхности, то значит можно достаточно свободно манипулировать с молекулами веществ, создавая принципиально новые, не ведомые природе конструкции.
    Будет ли это иметь какое-то значение для наук о жизни? Безусловно. «Новейшая история» биологии приводит немало примеров, когда прорывные направления физики, химии, технологии позволяли открывать двери ранее закрытые для биологов-исследователей. Неоспорима и практическая значимость нанотехнологии. Уже сейчас «игры с отдельными молекулами» привели к созданию наночипов, с использованием которых проводится диагностика в считанные минуты у постели больного. Удивительно точные системы доставки, которые строго определяют клетку-мишень и именно в нее вносят лекарственное вещество, позволяют избавлять больного человека от негативных последствий химиотерапии. Нанозонды используются для экологической диагностики загрязненных и неблагоприятных зон. И сам уровень познания живой материи принципиально изменился.
    В предложенной вашему вниманию книге приводятся сведения об использовании одного из основных инструментов нанотехноло-

Введение

гии — атомно-силового микроскопа. Именно атомно-силовая микроскопия позволила, наконец, не теряя высокого разрешения, исследовать биологические структуры (молекулы, клетки, ткани) в естественной для них жидкой среде. До этого у микроскопических методов были только две альтернативы:
   1)    фиксировать (убить) вирус, бактерию, эукариотическую клетку, но при этом сохранить высокое разрешение;
   2)    наблюдать за живой клеткой в буфере, но разрешение падало так сильно, что наблюдение за большинством физиологических процессов было затруднено.
   Наблюдение за вирусами и тем более биологическими молекулами становилось просто невозможным.
   Книга рекомендуется для студентов всех естественнонаучных специальностей, научных сотрудников, работающих в области микроскопии, физики, химии, биологии, медицины, и всех интересующихся современным состоянием науки. Использование атомно-силовой микроскопии в области биологических и медицинских исследований требует объединенных усилий и междисциплинарных связей. Физики и технологи совместно решают проблемы технического обеспечения и корректной модификации прибора в случае постановки принципиально новых задач. Программисты разрабатывают программное обеспечение для интерпретации получаемого результата. Биологи ставят задачи, готовят образцы, обдумывают новые подходы к использованию атомно-силовой микроскопии. Химики помогают с иммобилизацией органических молекул на поверхности зонда и подложки. Медики применяют результаты исследований в практических целях.
   В первой главе приводятся краткие сведения о принципах работы атомно-силового микроскопа, рассматриваются основные узлы прибора. Делается акцент на принципиальном для биологии моменте — работе в жидкости. Поскольку детальное рассмотрение метода не является центральной задачей этой книги, то для более подробного ознакомления с физическими принципами работы прибора можно порекомендовать книгу В.Л. Миронова «Основы сканирующей зондовой микроскопии». Во второй главе обсуждаются особенности работы с биологическими объектами. Здесь суммируются и литературные сведения об особенностях подготовки, иммобилизации биологических объектов, о необходимости тщательного подбора зондов, режимов сканирования и излагаются собственные экс

—1 Введение

периментальные подходы автора, наработанные за 10 лет. Некоторые интересные моменты, связанные с пробоподготовкой, можно найти также в книге под редакцией И.В. Яминского «Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров». Поскольку за последние 20 лет количество работ, посвященных использованию метода атомно-силовой микроскопии в биомедицинских исследованиях, колоссально, то рассмотрение результатов всех этих работ было бы непосильной задачей. Поэтому в последующих главах коротко рассматриваются принципиально новые для биологии и медицины результаты, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии. В последней главе перечисляются все направления, которые, на мой взгляд, являются самыми перспективными, и в ближайшем будущем будут активно развиваться и использоваться.
       Поскольку книга писалась в рекордно короткие сроки, возможно, она не свободна от некоторых неточностей. Буду признательна всем, высказавшим критические замечания. Хотелось бы поблагодарить Ю.Ю. Гущину, с которой меня связывало многолетнее и плодотворное сотрудничество в области АСМ-микроскопии. В обсуждении некоторых моментов работы для меня были особенно ценными замечания и предложения, высказанные кандидатом физико-математических наук Д.Е. Николичевым, С.Ю. Зубковым. В консультациях по вопросам особенностей химических связей не отказывал доктор химимческих наук В.Р. Карташов. Большое спасибо кандидатам физико-математических наук С.А. Орлову и Е.В. Дубровину любезно согласившихся предоставить свои сканы для иллюстрации книги. Я признательна аспирантам и студентам, принявшим деятельное участие в подготовке рукописи: Э.Р. Михеевой, Е.Н. Горшковой, Е.Е. Пудовкиной. Спасибо Л.Ф. Соловейчику за вдохновение, навеянное короткими сроками сдачи рукописи. Огромная благодарность А.Н. Плесковой за проделанную корректорскую работу.

ГЛАВА

1





                ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ
                АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ









               В названии «сканирующая зондовая микроскопия» объединены такие понятия, как сканирование (от англ, scan — пристально разглядывать, изучать), зондирование (от франц, sonder — исследование, разведка, промер глубины) и микроскопия (лат, mikros — мелкий, маленький и skopos — вижу), По сути, сканирующая зондовая микроскопия представляет собой набор методов, которые, используя зонд, движущийся по поверхности или над ней, дают полноценную картину топографии и свойств этой поверхности, Основными методами сканирующей зондовой микроскопии являются:
       • атомно-силовая микроскопия (АСМ);
       • сканирующая туннельная микроскопия (СТМ);
       • сканирующая фрикционная микроскопия (СФМ);
       • магнитно-силовая микроскопия (МСМ);
       • электросиловая микроскопия (ЭСМ);
       •    ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ), Семейство сканирующих зондовых микроскопов значительно обогатило экспериментальную базу физики и химии, предоставляя информацию об электрических, магнитных, топографических, оптических и других свойствах поверхностей, Все поколение сканирующих зондовых микроскопов относится к высокоразрешающим микроскопическим методам, В частности, сканирующий туннельный микроскоп в вакууме позволяет получать изображение поверхности с атомарным разрешением, Но в биологии и медицине из-за специфики исследуемых объектов наибольшее распространение получили атомно-силовая и оптическая ближнепольная микроскопии, Атомно-силовая микроскопия предоставляет широкий круг возможностей для работы на воздухе, в воде, в буферных растворах с пространственным разрешением от единиц до десятков нанометров,

¹⁰ -V

Глава 1. Общие принципы атомно-силовой микроскопии

   Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия дает оптические изображения с разрешением в десятки нанометров.

Атомы зонда

Атомы образца

   В названии «атомно-силовая микроскопия» закладывается основной принцип работы метода: силы межатомных взаимодействий между зондом и образцом (рис. 1.1).




Рис. 1.1. При подведении острого конца иглы (зонда) на близкие расстояния к поверхности образца возникают силы межатомных взаимодействий (F)


       Разберем основные узлы, из которых состоит атомно-силовой микроскоп. Условно конструкционные элементы атомно-силового микроскопа можно разделить на три части: механическую, оптическую и электронную систему обратной связи и корректировки сигнала.



            1.1.     МЕХАНИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ
            АТОМНО-СИЛОВОГО МИКРОСКОПА


            Основным сенсорным элементом АСМ является кантилевер (левер, консоль, зондовый датчик). Вся информация об исследуемой поверхности получается именно благодаря отклонениям кантилевера, которые регистрируются оптической системой атомно-силового микроскопа. По сути, консоль это пружина с малой жесткостью (к). В зависимости от материала, из которого кантилевер изготавливается, жесткость может быть выше (кремниевые кантилеверы — SiO₂, к варьируется от 0,1 до 400 Н/м) или ниже (нитридкремниевые кантилеверы Si₃N₄, к варьируется от 0,01 до 0,73 Н/м).
      Общая схема атомно-силового микроскопа представлена на рис. 1.2.
      Форма кантилеверов также варьируется. Они бывают V- или 1-образной формы (рис. 1.3). Для биологических исследований выбирают нитрид-кремниевые кантилеверы. Форма кантилевера выбирается в зависимости от поставленных задач, но, при прочих равных условиях, в случае исследования клеток предпочтение отдается V-образным кантилеверам, поскольку степень надежности у них выше. Хотя

1.1. Механические элементы атомно-силового микроскопа

Л

11

    нужно отметить, что при равной длине у триангулярных кантилеверов жесткость, а следовательно, и резонансная частота выше.


Рис. 1.2. Общая схема устройства атомно-силового микроскопа

I-образный кантилевер

ирамидальны зонд

Рис. 1.3. Виды кантилеверов

На конце кантилевера закрепляется зонд, который имеет, как правило, пирамидальную форму (хотя сейчас выпускаются зонды круглой формы, зонды с выращенной на конце острой иглой, функционализированные зонды и т. д.). При сканировании объекта зонд скользит по поверхности образца. Характер силового взаимодействия между зондом и образцом достаточно сложен, поскольку определяется свойствами зонда, образца и среды, в которой проводится ска

—' \r Глава 1. Общие принципы атомно-силовой микроскопии

нирование. В случае исследования биологических объектов на воздухе основной вклад в силовое взаимодействие зонда и образца дают: силы отталкивания, вызванные механическим контактом крайних атомов зонда и образца, силы Ван-дер-Ваальса, а также капиллярные (присасывающие) силы, связанные с наличием пленки воды и органического адсорбата на поверхности образца. Кроме того, и со стороны зонда при воздействии на достаточно мягкий образец и со стороны образца на зонд действует сила упругой деформации. Поскольку зонд движется над поверхностью, свой вклад во взаимодействие вносит сила трения. Однако большинство исследований биологических и медицинских препаратов проводится в жидкости, где нивелируются капиллярные силы, но присоединяются силы вязкого сопротивления среды, которые зависят от типа жидкости, в которой проводятся исследования.


    Рис. 1.4. Схема изгиба кантилевера и регистрации взаимодействия зонда и образца с помощью оптической системы

        При изменении силы взаимодействия зонда и образца кантилевер, на котором закреплен зонд, отклоняется (изгибается) и этот изгиб регистрируется с помощью оптической системы (рис. 1.4). Соотношение между силой, воздействующей на зонд со стороны образца и отклонением кантилевера, описывается законом Гука:

F = - кх,                        (1.1)


    где F — сила (Н); к — константа упругости кантилевера (Н/м); х — отклонение кантилевера.

1.1. Механические элементы атомно-силового микроскопа

■К

13

       Однако при сканировании происходит смещение зонда не только по нормали к поверхности, но и в латеральной плоскости. Все смещения регистрируются четырехсекционным фотодиодом (см. оптическая система атомно-силового микроскопа).
       К механической части атом-

    но-силового микроскопа относится также система точного позиционирования. Для перемещения зонда, закрепленного на кантилевере, используются пьезокерамические двигатели, которые перемещают зонд с точностью до ангстрема. Пьезокерамические материалы изменяют свои размеры под действием приложенного к ним электрического напряжения, так, например, пьезокерамический цилиндр при приложении напряжения вдоль его оси удлиняется и становится тоньше. Это свойство и исполь

Z

Рис. 1.5. Схема устройства триподного сканера

    зуется для перемещения зонда по одной координате, а для перемещения по трем координатам используется комбинация из трех взаимно перпендикулярных балок (трипод) (рис. 1.5).
       Однако в настоящее время большее распространение получили трубчатые сканеры. Изгибы одиночной трубки приводят к перемещению зонда по осям X и Y, а укорачивание или удлинение — по оси Z, т. е., как и в случае применения трипода, перемещение осуществляется в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Конструкции современных манипуляторов обеспечивают диапазон механического перемещения зонда до 150—200 мкм по осям Хи У и до 5—12 мкм по оси Z, т. е. в диапазон сканирования закладывается возможность исследования, как клеток, так и тканей и межклеточных контактов. Недостатком триподов является достаточно сильная асимметрия, но в отличие от трубчатого сканера он предоставляет больший диапазон сканирования по оси Z, поэтому для биологии, где высота клеток часто является ограничивающим фактором, лучше подходят именно триподные конструкции пьезоэлементов. Хотя у пьезокерамики имеются недостатки (крип и гистерезис), именно этот